Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований. РАЗДЕЛ I. ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ (В. Б. Сбойчаков, 2011)

2.1. Бактерии

Бактерии могут иметь округлую, палочковидную или извитую форму. Круглые бактерии называются кокками (одна клетка – кокк). Слово «кокк» произошло от греческого слова «коккос», что значит «семя». Обычно кокки имеют правильную шарообразную форму. Реже они несколько заострены (пневмококки) или имеют вид кофейных зерен или бобов (гоно-, менингококки).

Рис. 1. Формы кокков:

1 – микрококки; 2а – пневмококки; 2б – гонококки; 3 – стрептококки; 4 – тетракокки; 5 – сарцины; 6 – стафилококки

По расположению клеток после деления кокки могут быть подразделены на несколько групп (рис. 1). У некоторых из них после деления клетки расходятся и располагаются поодиночке. Такие формы называются микрококками. Иногда кокки при делении образуют скопления, напоминающие по форме гроздья винограда. Подобные формы называются стафилококками. Другие кокки после деления в одной плоскости остаются связанными парами. Это диплококки (рис. 1: 2а,2б). У стрептококков деление также происходит в одной плоскости, но клетки не отделяются друг от друга, и поэтому образуются различной длины цепочки. Некоторые кокки делятся в трех взаимно перпендикулярных плоскостях, что приводит к образованию своеобразных скоплений кубической формы. Такие скопления кокков называются сарцинами. Если после деления в двух взаимно перпендикулярных плоскостях клетки располагаются в виде сочетаний из четырех кокков, то такие скопления называются тетракокками.

Часто в природе встречаются цилиндрические, или палочковидные, бактерии. После 1875 г., когда немецкий ботаник Кон открыл существование спор, палочковидные бактерии, образующие споры, стали именовать бациллами.

У палочковидных бактерий концы бывают округлыми или заостренными. Разнообразно и расположение клеток после деления – одиночные палочки, по две, цепочками и т. п. (рис. 2).

Рис. 2. Различные формы палочковидных бактерий

Рис. 3. Извитые формы бактерий

Нередко встречаются извитые, или спиральные, бактерии. Медицинское значение имеют боррелии, трепонемы и лептоспиры, имеющие форму длинных изогнутых (несколько завитков) палочек, и вибрионы, представляющие лишь часть витка спирали и похожие на запятую (рис. 3).

Бактериальные клетки очень малы, их размеры исчисляются микрометрами (мкм). Кокки имеют диаметр около 0,5 – 1,0 мкм. Ширина палочковидных форм бактерий составляет от 0,5 до 1,0 мкм, а длина может достигать нескольких десятков микрометров. Размер бактерий может значительно изменяться в зависимости от температуры, состава среды и т. д.

Бактериальная клетка (рис. 4) окружена оболочкой. В цитоплазме содержатся ядерный аппарат, вакуоли, аналоги митохондрий – рибосомы, а также различного рода включения, обычно образующиеся в процессе обмена веществ.

Клеточная оболочка обладает определенной ригидностью (жесткостью) и вместе с тем эластичностью и способностью изгибаться. Клеточную оболочку можно разрушить ультразвуком, ферментом лизоцимом, тонкой иглой и т. д. При этом содержимое клетки – цитоплазма – с ее включениями вытекает и приобретает шаровидную форму. Отсюда следует, что оболочка придает бактериальной клетке определенную форму.

Рис. 4. Строение бактериальной клетки:

1 – капсула; 2 – клеточная оболочка; 3 – клеточная перегородка; 4 – жгутики; 5 – цитоплазматическая мембрана; 6 – нуклеоид; 7 – рибосомы; 8 – включения; 9 – плазмиды; 10 – споры (по: Пяткин К. Д. и Кривошеин Ю. С., 1980)

Внешняя оболочка (клеточная стенка) может быть удалена без повреждения протоплазмы. Полученная структура, окруженная лишь цитоплазматической мембраной, в слабо гипотонической среде принимает форму шара. Она была названа протопластом. Структуры, в которых стенка удалена неполностью или есть сомнения в ее полном отсутствии, принято называть сферопластами.

Масса клеточной оболочки составляет около 20 % от массы клетки. Клеточная оболочка часто бывает окружена слизистым слоем, который различается у отдельных бактерий как по толщине, так и по консистенции. Этот слой называется капсулой.

Капсула защищает клетку от неблагоприятных воздействий окружающей среды. Бактерии, окруженные капсулами, могут жить в такой среде, в которой рост некапсулированных бактерий ограничен. В некоторых случаях вещество капсулы может использоваться бактериями как пищевой резерв при отсутствии другой пищи.

К клеточной оболочке бактериальной клетки тесно прилегает внешний слой цитоплазмы — цитоплазматическая мембрана. Это мягкое образование, иногда называемое осмотическим барьером клетки, действует как полупроницаемая мембрана и контролирует транспорт ионов и молекул в клетку и из клетки. Цитоплазматическая мембрана составляет около 10 % от сухой массы клетки, состоит из полипротеидов и содержит до 75 % липидов клетки. Толщина мембраны не превышает 50 – 100 0. Электронная микроскопия ультратонких срезов бактерий показала, что цитоплазматическая мембрана состоит из трех слоев бимолекулярного листка липида, поверхности которого выложены монослоями белка. Нередко мембрана дает внутрицитоплазматические ответвления (инвагинации), приводящие к образованию особых телец — мезосом.

Мембрана и мезосомы выполняют функции, свойственные митохондриям высших организмов, в которых локализованы разнообразные ферментные системы.

Под цитоплазматической мембраной находится цитоплазма. Она обычно рассматривается как коллоидная система, состоящая из воды, белков, жиров, углеводов, минеральных соединений и других веществ, соотношение которых зависит от вида бактерий и их возраста.

Детальные исследования микромолекулярной организации и субмикроскопической структуры цитоплазмы выявили ее микрогранулярный характер. Микрогранулярная структура цитоплазмы представлена цитоплазматическими гранулами диаметром 100 – 200 0. Многие из этих гранул являются рибосомами – частицами с богатым содержанием белка и рибонуклеиновой кислоты. В бактериальной клетке содержится приблизительно до 10 000 рибосом, осуществляющих синтез белков в бактериальной клетке.

В цитоплазме бактерий имеются гранулы запасных питательных веществ. В качестве резервных питательных веществ в клетках бактерий могут накапливаться вещества, состоящие из углеводов – гликогена (животного крахмала) или гранулезы (близкой к крахмалу). При недостаточном поступлении углеродсодержащих веществ в среду гликоген или гранулеза постепенно исчезают из клеток бактерий.

У некоторых видов бактерий в клетках накапливаются жир и волютин. Последний состоит из неорганических полифосфатов и полиметафосфатов, а также веществ, близких к нуклеиновым кислотам. Волютин обнаруживается в виде крупных, хорошо видимых гранул, образующихся в больших количествах на средах, богатых глицерином или углеводами.

В цитоплазме бактериальных клеток расположен ядерный аппарат (иногда называемый нуклеоидом). Это образование также называют генофором, или бактериальной хромосомой. По сути дела это двойная, замкнутая в кольцо суперспирализованная молекула ДНК. Обычно ядерное образование (по одному на клетку) располагается в центральной части внутреннего содержимого клетки бактерий. В отличие от клеток высокоорганизованных организмов нуклеоиды бактерий не отделены от цитоплазмы мембраной.

Часть бактерий способна к активному передвижению. Существует два типа подвижных бактерий: ползающие и плавающие. Ползающее движение наблюдается у миксобактерий. Эти организмы могут совершать скользящие движения по поверхности в результате волнообразных сокращений, вызывающих периодическое изменение формы клетки.

Многие бактерии передвигаются с помощью особых нитевидных придатков — жгутиков, обусловливающих их подвижность благодаря своим спиральным волнообразным движениям вследствие ритмичных сокращений (рис. 5, см. цв. вклейку).

Кокки, за исключением отдельных видов, не имеют жгутиков. Среди бактерий цилиндрических форм приблизительно около половины имеют жгутики. Большинство спиралевидных бактерий подвижны.

Бактерии с одним жгутиком называются монотрихами, имеющие на одном или на обоих концах тела пучок жгутиков — лофотрихами. Перитрихами называются бактерии, имеющие жгутики по всей поверхности тела. Количество жгутиков у различных видов бактерий различно. Например, вибрионы имеют 1 – 3 жгутика, а у палочковидных бактерий обнаружено от 50 до 100 жгутиков.

Толщина жгутиков – около 0,01 мкм, а длина их во много раз превосходит длину тела бактерий. В химическом отношении жгутики представляют собой белок флагеллин и денатурируются при нагревании.

Жгутики не являются жизненно важной структурой для бактериальной клетки. Так, бактерии, обладающие жгутиками, можно вырастить в таких условиях, при которых жгутики не развиваются. У подвижных бактерий наблюдаются «фазовые вариации», т. е. жгутики присутствуют в течение одной фазы развития и отсутствуют в другой. Жгутики бактерий можно разрушить, при этом клетка будет оставаться жизнеспособной.

Свое начало жгутики берут от плотного тельца в цитоплазме, но прикрепляются они не только к цитоплазматической мембране, но и к клеточной. Протопласты, освобожденные от клеточной оболочки, сохраняют жгутики.

Бактериальные клетки (монотрихи), перемещаясь с помощью жгутика вдоль своей оси, совершают волнообразное движение. У перитрихов наблюдается оживленное кувыркание.

Скорость движения бактериальных клеток зависит от особенностей их аппарата движения и свойств среды – ее вязкости, температуры, рН, осмотического давления и др. Некоторые бактерии могут передвигаться при благоприятных условиях на расстояние, превышающее размеры клетки в 10 – 15 раз. Большинство же бактерий за секунду проходит расстояние, равное размеру их клетки.

Кроме жгутиков клетки бактерий могут иметь прямые отростки — фимбрии. Фимбрии значительно короче и тоньше жгутиков, но более многочисленны и обнаружены как у подвижных, так и у неподвижных организмов.

Некоторые бактерии способны образовывать споры (эндоспоры), тельца сферической или эллиптической формы, очень устойчивые к неблагоприятным условиям. Споры преломляют свет и четко видны в световом микроскопе (рис. 6). Обычно в клетке образуется одна спора — эндоспора. Споры не являются органами размножения, они служат для приспособления организма к неблагоприятным внешним условиям.

Рис. 6. Споры B. anthracis (по: Мотавкина Н. С. и Артемкин В. Д., 1976)

Формирование спор зависит от условий их роста. Споры могут оставаться живыми в условиях, когда вегетативные клетки, не образовавшие спор, погибают. Большинство спор хорошо переносят высушивание, многие из них остаются жизнеспособными даже при кипячении в течение нескольких часов. В сухом состоянии споры погибают лишь при сильном нагревании (150 – 160 °C) в течение нескольких часов.

Споры отдельных видов бактерий могут сохраняться веками.

Оболочка спор содержит мукопротеиды. Под слоями внешней оболочки лежит так называемая кора споры, которая служит барьером против проникновения воды и растворенных в ней веществ. Под корой расположена стенка споры, покрывающая цитоплазму, ядро и резервный материал. Цитоплазма споры имеет гомогенную структуру.

В спорах содержится мало воды (вследствие обезвоживания), что предохраняет белки от денатурации при высоких температурах. Общая схема спорообразования может быть представлена в следующем виде. В вегетативной клетке возникают уплотненные зоны цитоплазмы, носящие название первичной споры, или проспоры,которые, сливаясь, преломляют свет. Проспора окружена цитоплазматической мембраной. Дальнейшее развитие споры состоит в образовании оболочек и ее созревании.

Диаметр споры равен приблизительно диаметру клетки, в которой она образовалась, или несколько превышает его. У некоторых бактерий спора формируется на конце клетки, которая при этом несколько расширяется и приобретает вид барабанной палочки. У других бактерий спора образуется в центре клетки, которая либо не меняет формы (род Bacillus), либо в середине расширяется и принимает вид веретена (род Clostridium). Вегетативная часть клетки разрушается и исчезает, и остается только преломляющая свет спора, с трудом подвергающаяся окрашиванию.

Попадая в благоприятные условия, спора начинает «прорастать». При этом она разбухает не только в результате поглощения воды, но и вследствие роста клетки за счет резервного материала. Затем оболочки под влиянием давления, вызванного ростом, разрываются и дают трещину. Возникает новая вегетативная клетка. Способ, которым клетка выходит из споры, индивидуален для каждого вида и может использоваться в качестве видовой характеристики.

Благодаря жесткости стенки клетка сохраняет форму: шаровидную, палочковидную или извитую. Оболочка защищает клетку, сохраняя ее структурную целостность при изменении внешних условий, в частности при осмотических воздействиях. Наряду с мембраной она служит полупроницаемым барьером, обеспечивающим избирательное проникновение питательных веществ из окружающей среды и выделение высокомолекулярных соединений – токсинов или ферментов, участвующих во внеклеточном переваривании субстратов. Клеточная стенка определяет антигенную специфичность видов, является местом адсорбции фагов на клетке и участвует в процессах движения и деления.

При изучении химического состава клеточных стенок грамположительных (бактерий с толстой клеточной стенкой) и грамотрицательных бактерий (с тонкой клеточной стенкой) выявились существенные различия в их качественном и количественном составе (рис. 7).

Рис. 7. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий (А) и грамположительных (Б) (по: Поздеев О. К., 2001)

За механическую прочность стенки у этих групп микроорганизмов ответствен один и тот же гетерополимер — пептидогликан, вместе с тем его количественное содержание и локализация у разных бактерий не одинаковы. А такой компонент клеточной стенки, как тейхоевые кислоты, содержится в стенках только грамположительных бактерий. Электронномикроскопическое изучение срезов поверхностных слоев грамположительных и грамотрицательных бактерий также подтвердило неоднородность структуры их клеточных стенок.

Стенка грамположительных бактерий представляет собой однородную структуру толщиной приблизительно 20 – 80 нм. Главный ее компонент – пептидогликан – составляет 40 – 90 % от сухой массы стенки. Это универсальный гетерополимер. С ним ковалентно связаны полисахариды и тейхоевые кислоты. Он найден в клеточных стенках почти всех прокариотических клеток.

Жесткий слой пептидогликана окружает всю бактериальную клетку и является по существу одной крупной «мешковидной» молекулой. Молекула пептидогликана представляет собой параллельные полисахаридные цепи, связанные между собой короткими пептидными мостиками. Повторяющейся единицей полисахаридных цепей является муропептид. Таким образом, молекула пептидогликана – это замкнутая со всех сторон сеть, окружающая бактериальную клетку.

Структура пептидогликанового слоя обусловливает основные функции клеточной стенки – формообразующую и защитную.

Пептидогликан в клеточных стенках грамположительных бактерий ковалентно связан с полисахаридами особого типа – тейхоевыми кислотами. Эти растворимые в воде полимеры представляют собой длинные цепи, состоящие из остатков глицерина и рибита, связанных друг с другом фосфодиэфирными мостиками. Эти соединения могут составлять до 50 % массы сухих стенок. Из клеточных стенок бактерий были выделены два типа тейхоевых кислот: рибиттейхоевая, состоящая из остатков рибитфосфата, и глицеринтейхоевая, состоящая из остатков глицерофосфата. Небольшое количество глицеринтейхоевой кислоты ковалентно связано с мембранными гликолипидами. Это соединение называют липотейхоевой, или мембранной тейхоевой, кислотой. Клеточные стенки каждого штамма содержат кислоту только одного типа.

Значительная часть тейхоевых кислот располагается между клеточной мембраной и слоем пептидогликана. Связь тейхоевых кислот с пептидогликаном осуществляется путем образования фосфодиэфирной связи. Выступая на поверхности клетки, тейхоевые кислоты создают в ее оболочке высокую плотность регулярно ориентированных зарядов, способствуя проникновению ионов через внешние слои.

Кроме пептидогликана и тейхоевых кислот клеточные стенки грамположительных бактерий содержат также сопутствующие полисахариды – гликозамин, глюкозу, арабинозу, маннозу и (или) рамнозу. Тейхоевые кислоты и полисахариды клеточных стенок обладают антигенной активностью.

Липиды в стенках грамположительных бактерий содержатся в очень небольшом количестве или отсутствуют вовсе. В основном это длинноцепочечные жирные кислоты, соединенные сложноэфирными связями с полисахаридами стенки. Белки в клеточных стенках этой группы бактерий содержатся не всегда. Если они обнаруживаются, то связаны с внешней мембраной.

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий устроена сложнее, чем грамположительных. Она состоит из трех слоев: наружного – липопротеинового, среднего – липополисахаридного и внутреннего – пептидогликанового (ригидного).

Внутренний пептидогликановый слой тонкий (2 – 3 нм). Его содержание в клеточной стенке невелико – всего 5 – 10 % от массы сухого вещества стенки. Грамотрицательные бактерии пептидогликана отличаются от грамположительных низким содержанием поперечных сшивок и меньшим разнообразием диаминокислот. Пептидогликановый слой стенки может быть выделен в виде очень тонкого мешочка, сохраняющего форму и размеры исходной клетки.

Поверх тонкого пептидогликанового мешка располагается более толстый слой (8 – 10 нм), состоящий из липополисахаридов, белков и фосфолипидов, тонкая структура которого мало отличается от цитоплазматической мембраны.

Липополисахариды – главные компоненты внешнего слоя стенки. Они представляют собой сложную молекулу – «скелет» (липид А) и прикрепленный к нему полисахарид, образованный ядром и терминальной цепью повторяющихся единиц. У всех грамотрицательных бактерий ядро полисахарида имеет одинаковую структуру. Вариабельной частью являются повторяющиеся единицы – трисахариды либо разветвляющиеся тетра- или пентасахариды. Эти длинные боковые цепи выступают над поверхностью клетки, образуя так называемый «молекулярный ворс», и служат рецепторами для адсорбции многих фагов. Липополисахариды являются главными антигенными детерминантами клеточной стенки грамотрицательных бактерий.

Риккетсии – полиморфные грамотрицательные бактерии (рис. 8, см. цв. вклейку). Термин «риккетсия» впервые применил длиной до в 1916 г. бразильский микробиолог Э. да Роха-Лима в память Г. Риккетса, который, изучая сыпной тиф, заразился и трагически погиб. Большой вклад в изучение риккетсий внесли отечественные ученые: О. О. Мочутковский, П. Ф. Здродовский, Е. М. Голиневич и К. Н. Токаревич. По морфологическим признакам выделяют несколько форм риккетсий:

1) кокковидные – овал или эллипсоид диаметром 0,5 мкм, возможно образование диплоформ (гантелей), цепочек, конгломератов, в ряде случаев обнаруживается зернистость;

2) палочковидные образования длиной до 1 – 1,5 мкм с зернистостью на концах;

3) удлиненные, изогнутые, тонкие образования 3 – 4 мкм;

4) нитевидные (мицеллярные) формы длиной 10 – 40 мкм и более, иногда это зернистые изогнутые нити.

Доказана способность риккетсий образовывать фильтрующиеся формы. Риккетсии не образуют спор, имеют микрокапсулу, не обладают подвижностью.

Исследование риккетсий с применением электронной микроскопии и цитохимических методов показало, что микроорганизмы имеют две оболочки – внешнюю (выполняет функции клеточной стенки, состоит из трех слоев) и внутреннюю (толщиной 6 нм). В цитоплазме обнаружены гранулы величиной 20 – 70 нм и вакуоли диаметром 6 – 8 нм.

Риккетсии размножаются в эндотелиальных клетках капилляров, что приводит к закупорке сосудов и появлению сыпи.

Для риккетсий характерно большое содержание нуклеиновых кислот – как ДНК, так и РНК, что сближает их с бактериями. В теле риккетсий обнаружено большое количество липидов и мало углеводов, что характерно для вирусов.

Во внешней среде риккетсии малоустойчивы и сохраняются в организме членистоногих – клещей, блох и вшей. Исключением является возбудитель ку-лихорадки, который при низких температурах сохраняется во внешней среде около года.

Риккетсии являются внутриклеточными паразитами, поэтому не способны расти и размножаться на бесклеточных средах и мертвых тканевых субстратах. Особенностью риккетсий является их оптимальное размножение в живых тканях и клетках при температуре 35…36 °C. Однако уже при 40 °C рост и размножение риккетсий угнетается.

Рис. 9. Электронная микрофотография микоплазм

Особенности внутриклеточного паразитизма риккетсий следует рассматривать, исходя из места их локализации в инфицированной клетке. Некоторые риккетсии размножаются в цитоплазме (возбудители эпидемического и эндемического сыпных тифов и ку-лихорадки). Риккетсии – возбудители клещевых лихорадок – размножаются и в цитоплазме, и в ядре.

Микоплазмы – мелкие самореплицирующиеся грамотрицательные бактерии (прокариоты). Название «микоплазмы» было предложено в 1929 г. К. Новаком, оно подчеркивало их пластичность.

Микоплазмы относятся к классу Mollicutes («мягкокожие»).

При световой микроскопии в окрашенном по методу Романовского – Гимзы препарате видны полиморфные клетки – глобулы различной величины, зерна, иногда нити. При фазовоконтрастной микроскопии определяется гетерогенность популяции не только по величине, но и по оптической плотности отдельных клеток. Диаметр клеток 0,3 – 0,8 мкм (рис. 9). Иногда грушевидные, гантелевидные, ветвящиеся формы могут достигать 100 – 150 мкм либо встречаются в виде элементарных телец – гранул размером всего 0,1 – 0,25 мкм.

Такая полиморфность обусловлена отсутствием клеточной стенки, что качественно отличает их от остальных бактерий. Вместо клеточной стенки микоплазмы покрыты трехслойной цитоплазматической мембраной.

У бактерий под влиянием неблагоприятных факторов внешней среды (при применении антибиотиков, действующих на клеточную стенку) может возникать обратимое состояние L-формы. Клетка микоплазм очень просто организована, она содержит минимальное количество органелл: цитоплазму, рибосомы, циркулярную двунитчатую ДНК, мембранные внутриплазматические структуры и дополнительные органоиды. Мембрана составляет 15 % от массы всей клетки. На ее наружном слое выявляется капсулоподобный слой из полисахаридов. Он играет защитную и адсорбционную роль. Толщина капсулы 20 – 125 нм.

Цитоплазма содержит протеины, липиды, углеводы, РНК и ДНК.

Из дополнительных органелл выделяют сеть фибрилл, расположенных под цитоплазматической мембраной и прикрепленных к ее внутреннему слою. Эти белки выполняют функцию цитоскелета. Есть микроворсинки и терминальные структуры на одном из полюсов клетки – нити с заостренными концами длиной в клетку микоплазмы, которые обеспечивают некоторую скользящую подвижность и адгезию.

Полиморфизм тесно связан с репродукцией микоплазм. Для них характерно как равновеликое, так и неравномерное деление материнской клетки. Возможно также сегментирование цитоплазмы на несколько клеток с образованием в итоге мицеллярной структуры, из которой затем формируются сферические тела.

Новые особи могут возникать и в результате отпочковывания их от поверхности материнской клетки.

Жизненный цикл и метаболизм микоплазм зависит от клетки-хозяина, с которой они тесно связаны. Они персистируют и паразитируют на мембранах эукариотических клеток. Отдельные виды приобрели тропизм к определенной ткани.

Микоплазмы высокоустойчивы к действию низких температур. При температуре от –20 до –65 °C большинство бульонных культур сохраняют жизнеспособность в течение 12 мес., при температуре 4 °C – около 1,5 мес. Применение 50 %-ного глицерина в питательной среде резко увеличивает сроки их жизнеспособности. Устойчивость микоплазм к более высоким температурам зависит от состава среды, в которой они находятся. В средах с повышенным содержанием белка их устойчивость возрастает.

Микоплазмы чувствительны к изменению рН среды в щелочную сторону. При рН > 7,5 их жизнедеятельность резко угнетается.

Хламидии – мелкие грамотрицательные кокковидные микроорганизмы размером 0,25 – 1 мкм. По своим основным признакам они отнесены к бактериям, так как содержат два типа нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), рибосомы, мурамовую кислоту (компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий), размножаются бинарным делением и даже чувствительны к некоторым антибиотикам. Ранее хламидии относили к крупным вирусам. В отличие от бактерий они не растут на искусственных питательных средах, их культивируют в желточном мешке куриных эмбрионов и тканевых культурах так же, как и вирусы. Кроме того, хламидии являются строгими внутриклеточными паразитами и размножаются в основном в цитоплазме клеток человека. Хламидии помещены в одну таксономическую группу с риккетсиями, с которыми их объединяет внутриклеточный паразитизм.

Рис. 10. Структура клеточной стенки хламидий

Структура клеточной стенки хламидий соответствует общему принципу построения грамотрицательных бактерий (рис. 10). Она состоит из внутренней цитоплазматической и наружной мембран (обе являются двойными, обеспечивая прочность клеточной стенки). Антигенные свойства хламидий определяются внутренней мембраной, которая представлена липополисахаридами (LPS). В нее интегрированы так называемые белки наружной мембраны (Outer membrane proteins – OMP). На основной белок наружной мембраны – Maior Outer Membrane Protein (МОМР – элементарное тельце) приходится 60 % от общего количества белка. Оставшаяся антигенная структура представлена белками наружной мембраны второго типа – ОМР-2.

Длительное время считалось, что хламидии имеют характерный дефект ряда ферментных систем и не способны самостоятельно окислять глутамин и пируват, а также осуществлять фосфорилирование и эффективное окисление глюкозы. Ранее также предполагалось, что хламидии являются облигатными внутриклеточными энергетическими паразитами, использующими метаболическую энергию эукариотической клетки в виде АТФ и других макроэргических соединений. В настоящее время анализ генома показал, что хламидии способны синтезировать АТФ, хотя и в незначительных количествах, путем гликолиза и расщепления гликогена. У хламидий отсутствует пептидогликан – компонент клеточной стенки, существующий как у грамположительных, так и у грамотрицательных бактерий, но при этом в геноме содержатся гены, кодирующие белки, которые необходимы для его полного синтеза. Предполагается, что синтезируемые пептидогликан или пептидогликановый компонент имеют функции, отличные от функций других бактерий.

Методом сканирующей электронной микроскопии на поверхности хламидий были выявлены куполообразные структуры, пронизанные микрофиламентами. Функцию этой структуры связывают с транспортом питательных веществ от эукариотической клетки к паразиту. Обнаружение в геноме хламидий генов, кодирующих аппарат для III типа секреции, который обусловливает вирулентность грамотрицательных бактерий, позволило предположить, что это образование осуществляет передачу сигнала от паразита к эукариотической клетке.

2.2. Грибы

В отличие от бактерий грибы являются эукариотами. Это – гетеротрофные, одно- или многоклеточные организмы, составляющие особое царство живых организмов — Mycota.

Все грибы, за немногим исключением, имеют мицелиальное строение. Мицелий — это совокупность гифов (разветвленных нитей) гриба, из которых состоит его тело — таллом. Мицелий может быть либо одноклеточным, либо разделен перегородками (септами), т. е. многоклеточным. Грибы, имеющие слаборазвитый, несептированный мицелий, относятся к низшим. Таллом, состоящий из почкующихся или делящихся клеток, характерен для дрожжей. Дрожжи могут образовывать мицелиальные структуры, однако такой мицелий отличается от истинного, так как возникает в результате почкования, а не апикального роста гифов, и называется ложным, или псевдомицелием. Почкование присуще и некоторым мицелиальным грибам. Грибы, способные наряду с мицелием образовывать почкующиеся клетки, называются диморфными.

Клетка грибного мицелия всегда одета ригидной 4-слойной оболочкой (наружный глюкановый слой, глюкопротеидный, белковый и внутренний хитиновый). В наружных частях клеточной стенки нередко откладываются пигменты – меланины. Цитоплазматическая мембрана в качестве основных стероидов включает эргостерин и зимэстерол. Цитоплазма содержит эндоплазматическую сеть, аппарат Гольджи, митохондрии, рибосомы, лизосомы, ломосомы, вакуоли. Ядро у грибной клетки имеет четкие границы, определяемые двойной мембраной. Оно содержит ядрышко и хромосомы, которые состоят из ДНК и гистонов. Число гаплоидных хромосом у грибов никогда не бывает меньше 2 (3 – 28, а чаще 8). Грибная клетка часто бывает многоядерной.

По характеру роста мицелий грибов разделяют на субстратный (вегетативный) и воздушный (репродуктивный). Разновидностью субстратных гифов у паразитических грибов-дерматофитов являются инфекционные гифы, которые выполняют несколько функций: прикрепление к субстрату, внедрение в него (в кожу, волосы, ногти) и поглощение питательных веществ.

В отличие от растений грибы не содержат фотосинтезирующих пигментов. Этим аэробным организмам для роста требуется содержание в питательной среде углеродсодержащих и азотсодержащих компонентов, минеральных веществ, витаминов и др. Поверхностный и внутрисубстратный рост грибов обусловлен их способностью поглощать питательные вещества путем абсорбции. Развитая система гифов обеспечивает большую площадь поглощения. Оптимальная температура роста грибов составляет 28 – 30 °C (для патогенных – 37 °C и выше). Оптимум рН – 5,8 – 6,5. Однако грибы могут расти и в диапазоне температур от 0 до 60 °C.

2.3. Вирусы

Вирусы – уникальные микроорганизмы, расположенные на границе жизни, отличительными признаками которых являются обязательный паразитизм на генетическом аппарате живых клеток (растений, бактерий, насекомых, животных) и наличие в геноме нуклеиновой кислоты только одного типа. Вирусами поражены все формы жизни от растений и бактерий до человека. Способность вирусов вносить новую информацию в генетический аппарат клетки-хозяина определяет их роль как важнейшего фактора изменчивости и биологической эволюции всего живого. Наконец, с вирусами связывают возникновение опухолей, атеросклероза, диабета, разнообразных нервно-психических заболеваний и другой инфекционной патологии.

Вирусы как элементарная единица жизни – идеальный объект для молекулярных биологов и генетиков. Не случайно на вирусах сделаны величайшие биологические открытия ХХ в. – расшифровки генетического кода и механизма синтеза белка и нуклеиновых кислот. Многие опухоли животных индуцированы вирусами. В 1960-х гг. Л. А. Зильбером (1894 – 1966) впервые была выдвинута вирусогенетическая теория происхождения опухолей человека, и сейчас вирусологи активно включились в изучение их природы.

В последние десятилетия на фоне существенного снижения эпидемических бактериальных инфекций резко возрос удельный вес вирусных инфекционных заболеваний человека (до 80 % всей инфекционной заболеваемости). Грипп, аденовирусные инфекции, вирусные гепатиты и другие инфекции вирусной природы продолжают наносить большой ущерб здоровью людей. Существует немало опасных вирусов, которые могут использоваться в качестве весьма эффективного средства ведения биологической войны.

Вирусы – автономные генетические структуры, способные функциoнировать и репродуцироваться в восприимчивых к ним клетках (растений, бактерий, грибов, простейших, животных и человека), используя их генетический и белоксинтезирующий аппарат.

Дмитрий Иосифович Ивановский

Основоположником вирусологии является российский ученый, петербуржец Дмитрий Иосифович Ивановский (1864 – 1920), открывший на рубеже XIX – XX вв. уникальный мир вирусов. Еще будучи студентом, он приступил к изучению мозаичной болезни табака, которая наносила колоссальный экономический ущерб табакопроизводству. Пропуская через бактериальные фильтры Шамберлана сок из пораженных листьев, он установил, что данную болезнь вызывает мельчайший микроорганизм, который проходит через фильтр и способен вызывать заболевание при искусственном заражении. В своей диссертации (1888) он описал это заразное заболевание табака и указал, что возбудитель гораздо мельче бактерий, имеет корпускулярную природу и невидим в обычном световом микроскопе. В 1892 г. Д. И. Ивановский опубликовал материалы своих опытов, поэтому возникновение вирусологии ведет свой отсчет с этого времени.

Существует несколько гипотез происхождения вирусов.

1. Вирусы – потомки доклеточных форм жизни. Данная гипотеза основана на многообразии способов хранения генетической информации у вирусов. Различают 7 типов строения ДНК и 5 типов строения РНК-вирусов. Природа как бы отрабатывала на модели вирусов различные способы записи и сохранения генетической информации, отобрав для других живых структур наиболее надежную, двунитевую ДНК.

2. Вирусы являются результатом регрессивной эволюции одноклеточных организмов в процессе углубления паразитизма. Потомки внутриклеточных паразитировавших бактерий постепенно теряли те или иные атрибуты клетки, которые были не нужны при нахождении внутри клетки-хозяина.

3. Вирусы произошли от определенных клеточных генов, которые приобрели способность покидать клетку, но сохранили свойство относительно легко в нее возвращаться. Этой гипотезой, в частности, объясняется слабость и несвоевременность иммунного ответа организма человека на внедрение многих вирусов.

Вирусы – это форма жизни, которой присущи своеобразные атрибуты:

• способность к самовоспроизведению;

• способность передавать потомкам основные свойства – наследственность (отмечается консерватизм наследственности у возбудителя оспы и, наоборот, большая изменчивость у возбудителя гриппа и вирусов иммунодефицита человека);

• генетическая изменчивость; мутации генов вируса гриппа А происходят в миллион раз быстрее, чем в клетках, в котоклеточных рых они паразитируют; быстрому изменению подвержены поверхностные структуры вируса – гемагглютинины и нейраминидаза; иммунная система человека не успевает за этими изменениями, вот почему даже при наличии массы противогриппозных вакцин управлять данной инфекцией человек еще не научился; поверхностные структуры ВИЧ изменяются в 100 – 1000 раз быстрее, чем вирус гриппа, что осложняет создание надежных вакцин против «чумы ХХ века»;

• адаптация к определенной экологической нише, к определенному хозяину (растению, бактериям, грибам, простейшим, насекомым, земноводным, теплокровным животным и человеку); отдельные группы вирусов циркулируют со сменой хозяев, это полигостальные вирусы («рожденные» членистоногими – арбовирусы), размножающиеся в организме насекомых и животных; другие вирусы относятся к моногостальным и имеют узкий круг хозяев (бактериофаги);

• способность вызывать инфекцию, размножаться в клетке хозяина (проникает внутрь чувствительной клетки одна вирусная частица, а выходит из нее 100 – 1000 новых вирусных частиц); вирусы чаще вызывают персистентные инфекции (носительство), реже – заболевания, приводящие к гибели хозяина;

• функционирование вирусного генома по общим законам генетического кода.

Несмотря на то что вирусы относятся к представителям живого, их нельзя назвать организмами. Вирусы имеют ряд принципиальных отличий от других живых систем:

• малые размеры;

• очень простое строение вириона – геном, состоящий из ДНК или РНК, и капсид (белковая оболочка);

• отсутствие клеточного строения (цитоплазмы, мембран, рибосом);

• наличие у вируса только одного вида нуклеиновых кислот – ДНК или РНК, по этому принципу вирусы разделены на два подцарства;

• отсутствие способности к росту и бинарному делению;

• паразитизм на молекулярном (генетическом) уровне, в клетку проникает только геном вируса и полностью подчиняет ее своим интересам;

• способность к интеграции собственного генома с геномом клетки;

• невозможность существовать без клетки хозяина, так как репродукция возможна только в клетке хозяина.

Размеры вирусов определяются косвенно на микрофотографиях, микрофильтрацией либо ультрацентрифугированием. Вирус, находящийся вне клетки, называется вирионом.

Фотографирование осуществляется в электронном микроскопе. Однако, в связи с тем что вирусы прозрачны для электронов, препараты готовят специальным способом. Создают подложку из чистого углерода либо коллодия, на нее наносят вирионы в испаряющейся жидкости и проводят лиофильную сушку. На материал на подложке методом напыления под углом наносят тяжелые металлы (палладий, уран). Другим способом контрастирования является метод реплик – вируссодержащий материал, очищенный от балластных белков, заливают тонким слоем пластмассы. После высыхания образуется рельефная матрица, которую просматривают в электронном микроскопе. Негативное контрастирование можно осуществить путем помещения материала на подложку и добавления нейтрального раствора фосфовольфрамовой кислоты или урацилацетата, затекающего во все углубления вириона и создающего для электронов непроницаемый фон, на котором видны детали строения вирусных частиц.

Масса вирионов определяется косвенно при ультрацентрифугировании в единицах Сведберга.

Размеры вирусов колеблются от 20 нм у самых мелких до 350 – 400 нм (у вирусов семейства Poxviridae)(1нм=10^{– 9} м). Колебания размеров вирусов измеряют на микрофотографиях.

Размеры частиц можно определять при их фильтрации через заведомо известные диаметры фильтров. Крупные вирионы (тельца Пашена при оспе) можно видеть и в световой микроскоп в виде мелких точек.

Морфология вирусов учитывается при их классификации. Основной компонент вириона – белковая оболочка (капсид), содержащая нуклеиновую кислоту. Капсиды состоят из белковых субъединиц (капсомеров). Каждый капсомер – молекула белка с определенной молекулярной массой одного или разных видов белков. Например, у вируса табачной мозаики 2130 одинаковых капсомеров. Капсид включает пространство cor, у многих вирусов помимо нуклеиновой кислоты есть еще специальные ферменты. Состав белков и ферментов может быть различным: у вируса герпеса – 32 белка, у вируса оспы – 12 ферментов. Есть вирусы всего с 1 – 2 ферментами. Ферменты играют важную роль в репродукции вирусов.

По типу строения вирионов выделяют: спиральный тип симметрии (рабдовирусы, вирусы гриппа, парагриппа, коронавирусы); квазисферический – кубический, или икосаэдральный, тип симметрии; cмешанный – у Т-четных бактериофагов (головка в виде многогранника, а хвост в виде спирали).

У вируса табачной мозаики – спиральный тип симметрии вириона. Белковый чехол состоит из отдельных субъединиц в виде шестигранников. Капсомеры – белковые субъединицы, на внутренней поверхности которых расположен желобок, где находится спиралевидная РНК. Капсомеры идентичны друг другу: один и тот же белок, повторяющиеся белковые молекулы (экономится генетический материал). Диаметр капсида 15 – 18 нм, длина вириона до 300 нм (вид палочки). Капсид имеет жесткую структуру.

Тип симметрии определяется только нуклеокапсидом, суперкапсид при этом не учитывается. Например, вирус гриппа снаружи выглядит как сфера, нуклеокапсид имеет спиральный тип симметрии.

Икосаэдр – многогранник, состоящий из 12 вершин и 20 ребер. К данному типу симметрии относятся аденовирусы человека и животных. Капсомеры могут иметь разное строение и содержать разные белки. У аденовирусов боковые капсомеры в виде гексонов, а вершинные – пентонов (соседствуют с пятью капсомерами). От пентамеров отходят выросты (фибры). Это прикрепительные белки. Икосаэдр обеспечивает прочность капсида (защиту от внешних факторов), а прочная связь между капсомерами – минимум свободной энергии.

Многие вирусы имеют суперкапсид – дополнительную оболочку сложно устроенных вирусов, или пеплос. Структурные элементы суперкапсида – шипики, или пепломеры. У вируса гриппа их два типа: гемагглютинины и нейраминидаза; у парагриппа два комплекса – гемагглютинин и нейраминидаза вместе и второй так называемый белок слияния; у вирусов иммунодефицита человека они представлены гликопротеидами. Большинство вирусов, патогенных для человека, являются сложно устроенными. Если у вируса отсутствует суперкапсид, то это просто устроенный вирус.

У большинства сложно устроенных вирусов суперкапсид – это модифицированная (путем встраивания белков вируса) цитоплазматическая мембрана клеток хозяина. Модификация идет путем встраивания шипиков вируса в участки цитоплазматической мембраны (ЦПМ). Исключение составляют поксвирусы, у которых суперкапсид вирусоспецифический, так как имеются собственные гены, ответственные за синтез суперкапсида. Если культивировать один и тот же вирус в разных клетках, получим разные по биохимическому составу суперкапсиды. Шипы выполняют роль прикрепительных белков на поверхности чувствительных клеток. Если их удалить жирорастворителем или детергентом, вирус полностью теряет инфекционную активность.

Биохимия вирусов также хорошо изучена. В состав вириона входят: белки – 70 – 80 %; нуклеиновые кислоты – 4 – 6 % (РНК), 20 – 30 % (ДНК-вирусы); липиды и углеводы в незначительных количествах.

Вирусные белки – полипептиды, которые состоят из обычных левовращающих аминокислот, отличающихся лишь последовательностью построения. Принцип субъединичности построения капсида – повторяющиеся полипептиды небольшой величины – позволяет экономить генетический материал. Если бы капсид был построен из разных белков, требовался бы огромный геном. Так, у вируса табачной мозаики масса капсида 37,2$10⁶дальтон, а для кодирования этого капсида вирусом используется всего 600 нуклеотидов. Весь геном вируса составляет около 6000 нуклеотидов. Некоторые гены вирусов способны кодировать несколько белков со сдвигом рамки. Например, у вируса гриппа 8 генов, а кодируют они 10 вирусных белков.

Капсид за счет упорядоченности капсомеров по сравнению с простой пептидной цепью обладает меньшей свободной энергией. На уровне вирусов действует принцип саморегуляции – самосборки капсида. Принцип самосборки вирусных белков заключается в том, что при определенных условиях (рН, t°) наблюдается спонтанная сборка вирусных белков близких капсидов. При добавлении вирусных нуклеиновых кислот этот процесс упорядочивается.

В отличие от обычных у вирусных белков изменена чувствительность к протеазам. Белки вирусов выполняют защитную функцию, в том числе от нуклеаз, ультрафиолетового и ионизирующего излучений; обладают высокой, но не абсолютной устойчивостью, поскольку при репродукции необходимо «раздевание» вируса (освобождение генома). При этом изменяется чувствительность белков к протеазам. При проникновении в чувствительную клетку белки изменяются и легко гидролизуются протеазами. Вирусы проникают внутрь клетки за счет фагоцитоза вирусных частиц — виропексиса, либо слияния с клеточной мембраной.

Вирусные белки подразделяются на структурные и неструктурные. Структурные белки составляют суперкапсид, в составе сердцевины – геномные белки. Неструктурные белки не входят в состав вирусных частиц и обнаруживаются только в зараженной клетке в процессе репродукции. Это ферменты, осуществляющие функции регуляторов, и белки-регуляторы. Аминокислотная последовательность белков вирусов иная, чем у человека, поэтому их можно определять внутри клетки.

Синтез вирусных белков на рибосомах клеток идет по общим законам и регулируется информационной РНК (иРНК), которая образуется на матричных вирусных нуклеиновых кислотах. Белки вирусов выполняют защитную, адресную и регулирующие функции.

Защитная функция – это экранирование нуклеиновой кислоты вируса от химических факторов, нуклеаз и т. д., благодаря чему вирусы существуют тысячи лет.

Адресная функция состоит в проникновении только в нужную чувствительную клетку, а не в любую. Регулирующие функции выполняют внутриклеточные белки вирусов, ферменты, ферментные комплексы.

Вирусные нуклеиновые кислоты имеют существенные отличия от нуклеиновых кислот всех других существ. Обычно генетическая информация закодирована в двуспиральной ДНК и имеется однонитевая РНК (информационная, транспортная, рибосомальная). У вирусов в качестве геномной может быть как ДНК, так и РНК. У некоторых вирусов (РНК-геномных) вирионная РНК одновременно может выполнять роль информационной. Такие вирусы называют нитевыми. Если выделить в чистом виде такую РНК и поместить в клетку, то инфекция будет протекать так же, как если бы туда проник целый вирус. У других вирусов (нитевых) РНК не может выполнять функцию информационной.

Вирусы отличает многообразная структура нуклеиновых кислот. Их можно получить, разрушив вирус химическими (фенолом) или физическими (ультразвуком) факторами. Выделяют ДНК-содержащие вирусы, у которых она может присутствовать в виде: классической двунитевой (аденовирусы, герпесвирусы); двунитевой линейной с замкнутыми концами (оспа); двунитевой линейной с разрывами одной цепи (Т-фаги); с несколькими разрывами одной нити (каждый фрагмент – уникальный ген); двунитевой, замкнутой в кольцо со сверхвитками, (суперспирализация) или без них (тогавирусы); двунитевой, у которой внешняя нить замкнута в кольцо (L-нить), а у внутренней ¹/₃ отсутствует (S – нить, шорт) – гепаднавирусы; уникальной линейной однонитевой ДНК (парвовирусы); однонитевой замкнутой в кольцо (фаги).

РНК-содержащие вирусы также делятся на несколько типов: классический однонитевой линейный (пикорновирусы, тогавирусы, парамиксовирусы, рабдовирусы); линейный однонитевой фрагментированный (ортомиксовирусы); однонитевой фрагментированный, где каждый фрагмент замкнут в кольцо (буньявирусы); двунитевой с идентичными нитями (ретровирусы); двунитевой фрагментированный (реовирусы).

По химическому составу вирусные РНК и ДНК аналогичны клеточным, но в отличие от них содержат метилированный урацил.

Липиды имеют сложно устроенные вирусы, их наличие характерно для патогенных вирусов. Содержание липидов в вирусах различно: от 1,5 до 54 % (тогавирусы). Липидный состав вирусов непостоянен, у большинства это липиды клеточного происхождения. Липиды содержатся в суперкапсиде и зависят от клетки хозяина. Липидный состав различных чувствительных клеток при включении в них одного и того же вируса будет разным, тогда как одинаковые клетки при включении в них разных вирусов сохранят идентичность. Липиды выполняют важную защитную функцию, укрепляя белковый скелет суперкапсида. Они имеют вид липопротеидного или гликопротеидного комплекса. У поксвирусов синтезируются собственные липиды под контролем самого вируса, и поэтому состав липидов у них постоянен.

Углеводы входят в суперкапсид сложно устроенных вирусов преимущественно в составе различных шипов в виде моносахаридов, аминосахаридов (2 – 3 цепочки в комплексе с белковым или липидным компонентом – гликопротеидом, гликолипопротеидом). У вируса гриппа это гемагглютинин и нейраминидаза, у парагриппа – комбинированный шип гемагглютинина и нейраминидазы, у ВИЧ – поверхностные структуры gp 41- и gp 120-гликопротеиды, у вируса клещевого энцефалита – шипы гемагглютинина.

Углеводный компонент вируса определяется клеткой хозяина, укрепляет суперкапсидную структуру, придавая ей жесткость. Удаление гликопротеидных комплексов у сложно устроенных вирусов ведет к потере способности к адсорбции на чувствительных клетках. У просто устроенных вирусов углеводный компонент отсутствует.

В составе вирусов могут быть и другие компоненты. В состав полипептидов, например, часто включаются фосфаты (аденовирусы, ретровирусы, герпесвирусы, поксвирусы, ортомиксовирусы), их конкретная функция пока точно не установлена. Некоторые вирусы содержат микроэлементы: медь, молибден, а отдельные вирусы – целый набор ферментов: поксвирусы – 10, ВИЧ – 4, вирус гриппа – 3 фермента. Ферменты обеспечивают вирусную репродукцию: реакцию полимеризации (образования иРНК), репликацию (образование новых нитей нуклеиновых кислот) по принципу комплементарности. В ряде случаев ферменты синтезируются за счет генома вируса.

Вирусы также активно используют клеточные ферменты, например, у гриппа гемагглютинин находится в составе шипов в неактивном состоянии и для адсорбции на клеточном эпителии необходима протеолитическая активация гемагглютинина за счет ферментов клеточного секрета. Только после этого достигается соответствие прикрепительного белка структурам чувствительной клетки.

У ДНК-геномных вирусов ДНК-зависимая полимераза обеспечивает синтез иРНК. Благодаря ферментам происходит модификация синтезированной цепочки НК: удлинение цепи, укорочение, «подчищение» или процессинг нуклеиновых кислот – разрезание и удаление из определенных участков 1 – 2 нуклеотидов, а затем сшивание этого участка лигазой.

2.4. Бактериофаги

Бактериофаг – вирус бактерий, паразитирующий только на живой микробной клетке и являющийся важным генетическим фактором микроорганизмов. Открыт в 1917 г. французским ученым д’Эррелем. Название бактериофага происходит от греч. «фагос» – пожиратель. Бактериофаг имеет корпускулярное строение и представляет собой шаровидное тело (головку) с отростком. Вирус покрыт белковой оболочкой. В головке фага заключены ДНК или РНК. Размеры фага колеблются в пределах 45 – 100 нм (рис. 11).

По сравнению с вирусами фаги довольно устойчивы во внешней среде. Они хорошо переносят низкие температуры, но при +70 °C инактивируются. Формалин инактивирует фаги через несколько минут. Также губительно действуют на фаги ультрафиолетовое и ионизирующее излучения, однако в малых дозах они могут вызвать мутации.

Рис. 11. Начальные этапы взаимодействия фага с оболочкой бактерии (по: Воробьев А. А. и Кривошеин Ю. С., 2002)

Стадии взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой:

I фаза – адсорбция на клетке при соответствии фаговых рецепторов с рецепторами бактериальной клетки;

II фаза – внедрение фага в клетку, через канал фага в клетку попадает его нуклеиновая кислота; в отличие от вирусов капсидные белки головки и отростка остаются вне клетки;

III фаза – репликация фаговой РНК или ДНК, синтез фагоспецифических ферментов транскрипции и репликации;

IV фаза – сборка фаговых частиц, которая происходит гораздо быстрее, чем при репродукции других вирусов;

V фаза – выход фагов из клетки происходит по типу взрыва, во время которого зараженные бактерии лизируются.

Существуют вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные фаги вызывают инфекцию, заканчивающуюся лизисом бактериальных клеток и синтезом новых фаговых частиц. Умеренные фаги не лизируют зараженные ими клетки. ДНК этих фагов включается в хромосому бактерий и передается при их делении неограниченному числу потомков. Такой тип взаимодействия фага с клеткой называется лизогенией, а бактерии, несущие в геноме фаговую ДНК (профаг), называются лизогенными. Они широко распространены в природе и обнаруживаются в воде, почве, сточных водах, испражнениях больных и других биосубстратах.

Репродукция вирулентного фага в клетках бульонной бактериальной культуры сопровождается их лизисом и просветлением среды. На газоне чувствительных бактерий, выращенных на агаровой среде в чашке Петри, фаги образуют зоны очагового или сплошного лизиса, что зависит от их концентрации. Зоны очагового лизиса получили название негативных колоний фага или стерильных пятен-бляшек. Они имеют морфологию, характерную для определенных фагов, и образуются из одной фаговой частицы при внедрении ее и последующей репродукции в клетках микроорганизмов.

Большинство фагов характеризуется видоспецифичностью в отношении бактерий. Однако существуют фаги, способные поражать только отдельные варианты одного и того же вида бактерий. Их используют для определения фаговаров (фаготипов) внутри данного вида.

В практической работе фаги применяют для:

– фаготипирования бактерий, что важно для маркировки исследуемых культур при эпидемиологическом анализе заболеваний;

– дифференцировки бактериальных культур с целью установления их видовой принадлежности;

– фагодиагностики, заключающейся в выделении фага из организма больного (например, из испражнений), что косвенно свидетельствует о наличии в материале соответствующих микроорганизмов.

Фаги, так как они обладают антигенными свойствами, используют также для иммунизации животных с целью получения диагностических антифаговых сывороток. Кроме того, в отдельных случаях их применяют для лечения инфекционных заболеваний (фаготерапии).

2.5. Прионы

В 1957 г. американский врач Д. К. Гайдушек при обследовании в Новой Гвинее больных куру – смертельным дегенеративным заболеванием мозга, связанным с ритуальным каннибализмом, обратил внимание на сходство этого заболевания с давно известным медленным вирусным заболеванием овец – скрепи. Позже было выявлено сходство в развитии и некоторых других заболеваний, например болезни Крейтцфельдта – Якоба (БКЯ). За исследования в этой области Д. К. Гайдушек в 1976 г. был удостоен Нобелевской премии.

Инфекционный агент этих заболеваний имел важные отличия от других возбудителей, в том числе вирусов (табл. 1): он не был виден в электронный микроскоп, не вызывал иммунных реакций, не инактивировался факторами, разрушающими нуклеиновые кислоты, имел крайне малые размеры (меньше 25 нм). Ранее было высказано предположение, что этот агент представляет собой принципиально новый тип возбудителя – инфекционный белок.

Таблица 1

Сравнительная характеристика вирусов и прионов

В 1982 г. американский ученый С. Прузинер, используя новые подходы к накоплению и очистке возбудителя, выделил соответствующую протеиновую фракцию. Он доказал, что этот белок способен вызывать спонгиформную энцефалопатию и назвал его прионом (сокращение от протеиновые инфекционные нуклеолы). В 1984 г. С. Прузинер установил, что прионы лежат в основе как наследственных, так и инфекционных болезней, что вызвало полное недоумение многих специалистов. Значительно позже, в 1997 г., этому ученому была присуждена Нобелевская премия в области физиологии и медицины за серию научных работ о прионах.

Существуют так называемые «конформационные» болезни, которые характеризуются пространственным изменением третичной структуры внутриклеточных белков с образованием жесткой бетаструктуры вместо нормальной альфа-спиральной. Бета-структуры, в отличие от альфа-структур, становятся устойчивыми к расщепляющим их ферментам, вследствие чего накапливаются, агрегируются и полимеризуются, формируя различные специфические и неспецифические внутриклеточные включения (фибриллы, агрегаты и амилоид). Некоторые из них приобретают новые, в частности нейротоксичные, свойства, становясь причиной развития целого ряда нейродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера, бокового амиотрофического склероза и др. ).

Конформационные изменения белков в организме в определенных условиях происходят и в норме, однако в условиях патологии процесс изменения структуры белка резко ускоряется, что может быть обусловлено как эндогенными (мутации, ошибки транскрипции и трансляции), так и экзогенными факторами (окислительный процесс, вирусы и их генные продукты). Таким образом, среди конформационных болезней можно выделить инфекционные, наследственные и спорадические формы. Некоторые конформационные болезни могут проявляться во всех трех формах. К числу последних относятся крайне актуальные в настоящее время прионные инфекции. Прионы представляют собой сиалогликопротеид (PrP) с молекулярной массой 33 – 35 кД, состоящий из 254 аминокислот (включая 22-членный N-терминальный сигнальный пептид), к боковым цепям которых присоединены остатки сахаров. Прионный белок очень устойчив к различным физическим факторам и химическим веществам. Инактивации его можно добиться только обработкой 90 % фенолом и автоклавированием при самом жестком режиме (табл. 2).

Таблица 2

Устойчивость прионов к различным воздействиям (по: Шлопов В. Г., 1998)

Сиалогликопротеид PrP входит в состав наружных клеточных мембран и является компонентом многих клеток организма, хотя максимальная его концентрация выявляется в нейронах. Делеция гена PRNP не приводит к немедленной смерти животных, однако через 70 недель у мышей развиваются прогрессирующие симптомы атаксии и нарушается моторная координация.

Прион PrP существует в двух изоформах: нормальной, неинфекционной (PrP^C), и патологической, инфекционной (PrP^Sc). Молекулярная масса их одинакова и кодируется одним геном, расположенным на коротком плече 20-й хромосомы. Этот ген найден у многих млекопитающих и птиц.

Прион PrP^Sc значительно более устойчив к действию клеточных протеаз по сравнению с PrP^C и может денатурироваться и ренатурироваться без потери инвазивной способности. При анализе первичной структуры PrP^C выявлена его 80 %-ная гомология у разных видов животных. При этом около 42 % нормальной изоформы PrP^C составляют альфа-спирали при почти полном отсутствии бетаскладчатых структур (тяжей), в то время как для патологического PrP^Sc характерны бета-тяжи (43 %) при уменьшении количества альфа-спиралей (30 %). При обработке реагентами, уменьшающими образование бета-тяжей, снижается инфекционность прионов и их устойчивость к действию протеазы К. Таким образом, в основе прионных заболеваний лежит посттрансляционное изменение конформации нормального клеточного белка с разрушением альфа-спиралей и образованием бета-структур.

В настоящее время различают не менее четырех типов прионных белков. Доказано, что с первым и вторым типами PrP^Sc связаны фамильные, спорадические и ятрогенные формы болезни Крейтцфельдта – Якоба. Четвертый тип, возможно, является возбудителем новой атипичной формы этой болезни и больных животных («бешенство» коров).

Возможна как наследственная передача по аутосомно-доминантному типу наследования, так и заражение алиментарным или парентеральным (ятрогенным) путем, причем при повторном инфицировании существует риск кумулятивного эффекта. Ятрогенный путь заражения может быть связан с использованием инфицированных электродов, хирургических, стоматологических и других инструментов, а также ряда лекарственных препаратов. При этом остается неясным вопрос безопасности использования препаратов, изготовленных из мозга и лимфоидной ткани крупного рогатого скота, – миелопептидов, стимуляторов, церебролизина, холестерина и т. д.

Алиментарный путь заражения связан с употреблением продуктов, инфицированных прионами. Этому способствует устойчивость прионов к протеазам пищеварительных соков. Широко известная эпидемия бешенства коров, затронувшая половину коровьих стад в Великобритании, была вызвана костной мукой, добавлявшейся в корм животным. Костная мука изготовлялась из мяса и костей погибших овец, большинство из которых страдали болезнью скрепи. После изменения технологии обработки костной муки (прекращения экстрагирования жиров и снижения температуры ее стерилизации) в начале 1980-х годов было зарегистрировано два случая «бешенства» коров. Далее эпизоотия развивалась крайне интенсивно, достигнув пика к 1992 г. В 1990 г. описан первый случай губчатой энцефалопатии у кошки в Великобритании, вскоре поступили сообщения о подобных заболеваниях у пумы, гепарда, тигра и других представителей семейства кошачьих, а также у диких экзотических копытных в лондонском зоопарке. Временно́е и географическое распространение губчатой энцефалопатии кошек дало основание полагать, что ее источником является корм, полученный из мяса крупного рогатого скота, а заражение копытных обусловлено использованием костной муки. В 1996 г. представлены доказательства – идентичность штаммов инфекционного прионного белка – в пользу связи потребления мяса зараженных животных и так называемого «нового варианта» болезни Крейтцфельдта – Якоба (БКЯ), отличающегося более коротким инкубационным периодом (2 – 5 лет), молодым возрастом заболевших (до 40 лет) и клиническими проявлениями, аналогичными таковым при болезни куру.

Таблица 3

Инфекционность тканей, биологических жидкостей и экскретов больных (по данным ВОЗ)

Остается проблемой также использование субпродуктов в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности, например желатина, который изготавливается из кожи и костей, но может содержать небольшое количество костного мозга, инфицированного прионами, а также кремов и других косметических и фармацевтических препаратов, содержащих коллаген, полученный из тканей коров и т. д. (табл. 3). Необходимо отметить, что ткани остаются заразными даже после их фиксации формалином. Существует видовой барьер к прионным инфекциям у различных видов животных, что может быть связано с различными структурами генов, кодирующих PrP. В большинстве случаев эти барьеры не абсолютны, они не препятствуют, а только затрудняют передачу инфекции от особей одного вида особям другого вида. На межвидовой перенос влияют два фактора: во-первых, эффект вида донора, связанный с различиями в последовательностях гена PrP у двух видов донор – реципиент, и, во-вторых, штаммовые особенности приона, определяющие степень сложности преодоления межвидового барьера.

Первоначально после заражения прионы появляются в лимфоидной ткани – лимфатических узлах, селезенке, тимусе, особенно в В-клеточных зонах. О важной роли В-лимфоцитов в патогенезе прионных инфекций говорит устойчивость мышей к скрепи с дефицитом этих клеток. В лимфоидной ткани происходит частичная репликация прионов, затем они по нервам достигают ближайших аксонов. После размножения в аксонах прионы продвигаются к спинному, затем к головному мозгу со скоростью около 1 мм в день, где их репликация может происходить как в нейронах, так и в глиальных клетках. Внутриклеточное накопление PrP^Sc в головном мозге проявляется вакуолизацией и дегенерацией нейронов, их гибелью и реактивным астроцитозом. Внеклеточные скопления PrP^Sc выявляются как амилоидные бляшки. Максимум инфекционности достигается задолго до клинических проявлений заболевания, с чем связаны трудности ранней диагностики и опасность передачи инфекции с продуктами питания.

Заболевания, вызываемые прионами, характеризуются длительным инкубационным периодом (до 40 лет), отсутствием воспалительных изменений, прогрессированием симптомов без ремиссий и выздоровления, отсутствием продукции интерферона и чувствительности к нему, интактностью Т- и В-клеток, устойчивостью к иммуноподавляющему или иммуностимулирующему действию гормонов и других препаратов.

Все прионные инфекции характеризуются прогрессирующей дегенерацией ЦНС с преимущественным поражением серого вещества, выявляется также вторичная потеря миелина и поражение белого вещества. Макроскопически выявляется снижение объема мозга и уменьшение толщины его коры, гистологически – вакуолизация нейронов и предельное уменьшение их количества, что сопровождается пролиферацией и гипертрофией астроцитов. Для прионных инфекций характерны также спонгиоформные изменения с образованием вакуолей от 5 до 100 мкм в диаметре между телами нервных клеток. В мозговой ткани накапливается патологический белок с массой 27 – 30 кД, состоящий из 55 аминокислот, который является дериватом большого белка-предшественника PrP^Sс после его расщепления протеазой К.

Таблица 4

Прионные заболевания человека и животных

Прионные заболевания всегда смертельны, гибель наступает от истощения или от пневмонии. Их типичными клиническими проявлениями являются:

– расстройства чувствительной сферы – амнезия различной степени, потеря и извращение чувствительности, выпадение функций органов чувств;

– нарушения двигательной сферы – атаксия, обездвиживание, атрофия мышц, в том числе дыхательных, параличи;

– нарушения психики – утрата профессиональных навыков, депрессия, сонливость, агрессивность, снижение интеллекта до полной деменции.

К прионным болезням человека в настоящее время относят пять заболеваний (табл. 4), которые обусловлены различными мутациями одного PRNP гена человека: болезнь Крейтцфельдта – Якоба (БКЯ); синдром Герстмана – Штраусслера – Шейнкера (СГШШ); синдром фатальной бессонницы; болезнь куру; хроническая прогрессирующая энцефалопатия детского возраста (синдром Альперса).

В настоящее время не существует эффективной этиотропной и патогенетической терапии прионных болезней. На ранних стадиях используется симптоматическая терапия для коррекции расстройств сна, поведенческих нарушений, миоклонии; на поздних – поддерживающая терапия.

Перспективным направлением в лечении прионных заболеваний можно считать создание препаратов, направленных на стабилизацию альфа-структур PrP, снижение их количества и предотвращение конформационных изменений. В эксперименте амфотерицин, некоторые ингибиторы синтеза вирусного гликопротеида и кортикостероиды увеличивают инкубационный период, а некоторые антибиотики несколько удлиняют продолжительность жизни животных, зараженных скрепи. Брефелдин А разрушает аппарат Гольджи и препятствует синтезу PrP^Sс в инфицированной культуре клеток.

Профилактика прионных заболеваний включает:

• использование генно-инженерных гормональных препаратов;

• ограничение трансплантации тканей;

•соблюдение при работе с биологическими жидкостями и тканями правил, предусмотренных для работы с больными СПИДом;

• уничтожение хирургических инструментов, используемых у больных БКЯ либо обработка их гипохлоритом с последующей очисткой и автоклавированием при температуре 134 °C в течение 1 часа;

• запрет на использование пищи, подозрительной на содержание инфекционного прионного белка;

• разведение пород домашних животных, резистентных к прионам;

• выявление носителей патогенных мутаций и т. п.

Прижизненная диагностика прионных заболеваний затруднена. Для установления точного диагноза прионного заболевания человека требуется, чтобы был выявлен один из четырех дополнительных критериев:

• наличие PrP амилоидных бляшек;

• способность ткани к заражению спонгиоформной энцефалопатией животных;

• наличие изоформ прион-протеина PrP^Sc;

• наличие патогенного мутированного гена PRNP.

На ранних этапах заболевания большое значение в диагностике прионных болезней имеет электроэнцефалографическое исследование, при котором можно выявить замедление биоэлектрической активности. Комьютерная томография позволяет определить прогрессирующую атрофию головного мозга.

Для выявления прионного белка PrP^Sc в биоптате мозговой ткани и глоточной миндалины используются методы иммуноцитохимического анализа, гисто- и иммуноблоттинга.

Для определения инфекционности тканей проводится внутримозговое заражение лабораторных животных. Исследование может проводиться только в специализированных лабораториях и зависит от ряда факторов, например от видового барьера. В. А. Зуевым предложено использование перевиваемых культур клеток невриномы узла тройничного нерва крыс для культивирования прионов и прижизненной диагностики прионных заболеваний, а также выявления антител к нейрофиламентам.

3.1. Метаболизм

Метаболизм представляет собой совокупность двух противоположных, но взаимосвязанных процессов: энергетического метаболизма (катаболизма) и пластического (конструктивного) метаболизма (анаболизма).

Прокариоты, как и эукариоты, в процессе ферментативных катаболических реакций выделяют энергию, которая аккумулируется в молекулах АТФ. В процессе ферментативных анаболических реакций эта энергия расходуется на синтез многочисленных макромолекул органических соединений, из которых в конечном итоге строятся биополимеры – составные части микробной клетки. Взаимосвязь анаболизма и катаболизма выражается также в том, что на определенных этапах метаболизма образуются одинаковые промежуточные продукты (амфиболиты), которые используются в обоих процессах.

Метаболизм микроорганизмов характеризуется ярко выраженным разнообразием. В качестве питательных веществ микробные клетки используют различные органические и минеральные соединения.

3.2. Источники углерода и типы биологического окисления

В соответствии с законом сохранения энергии все функции живого организма, требующие затраты энергии, должны осуществляться за счет внешних источников энергии, которые бывают двоякого рода.

Автотрофные организмы могут синтезировать органические соединения из неорганических веществ (прежде всего из СО₂ иН₂О), используя дополнительные источники энергии. Гетеротрофные организмы используют в качестве источника энергии готовые органические «питательные вещества» и живут за счет автотрофных организмов и их биосинтетических процессов.

При распаде органических веществ химически связанная энергия освобождается (катаболизм, диссимиляция). Этот распад без участия кислорода (анаэробные условия) приводит к образованию органических продуктов, богатых энергией, таких, как органические кислоты или этанол (брожение), а при использовании кислорода (аэробные условия) – конечных продуктов: углекислого газа и воды (дыхание), бедных энергией.

Суммарные уравнения дыхания складываются из двух процессов:

1) постепенного расщепления субстрата с отнятием водорода, который связывается с коферментами;

2) постепенного окисления водорода в результате переноса его на кислород.

Расщепление углеводов происходит в результате последовательного воздействия на субстрат различных ферментов. Этот процесс начинается с гликолиза. При подготовке к расщеплению различные углеводы превращаются в фруктозо-1,6-фосфат. Гликолиз – это процесс окислительного расщепления, происходящий в цитоплазме бактерий и ведущий от фруктозо-1,6-фосфата к промежуточному продукту – пировиноградной кислоте.

При разных видах брожения дальнейшая судьба продуктов гликолиза – пировиноградной кислоты и NAD ⋅ Н – различна.

При молочнокислом брожении (стрептококки, лактобациллы) водород переносится на пировиноградную кислоту и образуется молочная кислота:

При спиртовом брожении (сахаромицеты) пировиноградная кислота сначала декарбоксилируется, т. е. от нее отщепляется СО₂,азатем промежуточный продукт (ацетальдегид) восстанавливается в этиловый спирт (этанол) в результате переноса водорода:

При маслянокислом брожении (клостридии) пировиноградная кислота превращается в ацетат [C H ₃ −C=0], связанный с коферментом (ацетил-СоА). Два таких остатка соединяются в ацетоацетат, который восстанавливается до н-масляной кислоты (СН₃СН₂СН₂СООН).

В 30-е годы XX века В. А. Энгельгардом, О. Варбургом, Ф. Лимпаном и Д. Диккенсаном было доказано, что кроме гликолиза в бактериальных клетках существует еще один путь расщепления углеводов – ступенчатый окислительный распад гексоз до пентоз и других сахаров с более короткой цепью. Ключевую роль в таких реакциях играют пентозофосфаты, в связи с чем этот цикл называется пентозофосфатным.

Суммарное уравнение этого цикла имеет вид:

Небольшое число микроорганизмов, к которым относятся главным образом бактерии из рода Pseudomonas, получают энергию с помощью специфического метаболического пути – Энтнера – Дудорова. Существует предположение, что он появился в связи с высокой потребностью прокариот в пировиноградной кислоте как кратчайшему пути ее образования (всего 4 реакции, тогда как при гликолизе она образуется после 9 реакций).

В аэробных условиях пировиноградная кислота (ПВК) подвергается окислительному декарбоксилированию в цикле трикарбоновых кислот до конечных продуктов: СО₂ иН₂О. Непосредственным реакциям цикла предшествует подготовительная фаза – окисление пировиноградной кислоты до ацетилкоэнзима А (ацетил = СоА):

Окислительное декарбоксилирование ПВК катализируется пируватдегидрогеназной системой. Она состоит не менее чем из трех ферментов, которые используют пять коферментов: тиамидинфосфат, амид липоевой кислоты, коэнзим А, FAD, NAD.

При аэробном окислении 1 моля глюкозы клетка получает 38 молей АТФ, тогда как при гликолизе только два.

В цикле трикарбоновых кислот от субстратов отделяются протоны и электроны. Они поступают на коферменты NAD⁺ и FAD⁺, которые передают их в дыхательную цепь, образованную окислительно-восстановительными ферментами, находящимися на плазматической мембране у прокариот и на внутренней мембране митохондрий у эукариот. Передвигаясь от одного переносчика электронов к другому, электроны опускаются на все более низкие энергетические уровни, отдавая порциями свою энергию. В последнем звене цепи они восстанавливают молекулярный кислород. Освобожденная при переносе электронов по дыхательной цепи энергия запасается в фосфатных связях АТФ. Окислительно-восстановительные ферменты представлены дегидрогеназами, флавопротеидами, цитохромами, а также убихиноном и белками, содержащими железо и серу.

Автотрофный метаболизм осуществляется бактериями путем фотосинтеза и хемосинтеза. Для облигатных автотрофов фотосинтез – единственный источник энергии: у них нет процессов диссимиляции, поставляющих АТФ. Фотосинтез состоит из двух фаз: световой и темновой. Световой процесс можно представить так:

Во время темновой фазы атомы водорода, поставляемые световыми реакциями, используются для восстановления СО₂ до углеводов согласно общему уравнению фотосинтеза:

При этом на каждый моль синтезированного углевода запасается около 160 кДж энергии.

Русским микробиологом С. Н. Виноградским было показано, что хемосинтезирующие бактерии получают энергию при окислении неорганических соединений:

Хемосинтез (в отличие от фотосинтеза) – облигатно аэробный процесс.

При аэробном (кислородном) дыхании конечным акцептором электронов служит кислород, а при анаэробном (бескислородном) – неорганические соединения. Исходя из этого, по типу дыхания выделяют следующие группы бактерий:

– строгие (облигатные) аэробы, которые размножаются только в присутствии кислорода, например псевдомонады;

– микроаэрофилы, которым требуется меньшее количество кислорода, например кампилобактеры;

– факультативные анаэробы, которые могут размножаться как в аэробных, так и в анаэробных условиях, например энтеробактерии;

– строгие (облигатные) анаэробы, которые размножаются только в бескислородных условиях, например бактероиды.

Отдельно следует выделить аэротолерантные бактерии, которые способны расти в присутствии кислорода, но они не используют этот кислород в качестве источника энергии, а получают энергию при брожении, например молочнокислые бактерии.

Токсическое действие кислорода на бактерии объясняется отсутствием у них ферментов каталаз и системы регуляции окислительно-восстановительного потенциала.

3.3. Источники азота

Для синтеза азотсодержащих соединений (аминокислот, пуринов, пиримидинов, некоторых витаминов) микроорганизмы нуждаются в доступном источнике азота. Одни из них способны усваивать молекулярный азот из атмосферы (азотфиксирующие бактерии), другие ассимилируют только азотсодержащие органические соединения.

Микроорганизмы, способные синтезировать все необходимые им органические соединения из глюкозы и солей аммония, называют прототрофами. В отличие от них микроорганизмы, не способные синтезировать какое-либо из жизненно необходимых соединений, называют ауксотрофами. Они ассимилируют эти и другие соединения в готовом виде из окружающей среды или организма хозяина. Ауксотрофами чаще всего являются патогенные или условно-патогенные для человека микроорганизмы.

Кроме азота и углерода всем микроорганизмам для биосинтетических реакций необходимы соединения, содержащие фосфор, серу, а также ионы магния, калия, кальция, железа и другие микроэлементы.

Потребность того или иного микроорганизма в определенных факторах роста является стабильным признаком, который используется для дифференциации и идентификации бактерий, а также при изготовлении питательных сред для лабораторных и биотехнологических целей.

Многие микроорганизмы, особенно бактерии, нуждаются в тех или иных аминокислотах (одной или нескольких), поскольку не могут их самостоятельно синтезировать: клостридии нуждаются в лейцине, тирозине; стрептококки – в лейцине, аргинине и др. Такого рода микроорганизмы называются ауксотрофными по тем или иным аминокислотам, которые они не способны синтезировать.

Пуриновые и пиримидиновые основания и их производные (аденин, гуанин, цитозин, урацил, тимин и др.) являются факторами роста для разных видов стрептококков, некоторые азотистые основания нужны для роста стафилококков и других бактерий. В нуклеотидах нуждаются некоторые виды микоплазм.

Липиды, в частности компоненты фосфолипидов – жирные кислоты, необходимы для роста некоторых стрептококков и микоплазм. Все виды микоплазм ауксотрофны по холестерину и другим стеринам, что отличает их от других прокариот. Эти соединения входят в состав их цитоплазматической мембраны.

Витамины, главным образом группы B, входят в состав коферментов и или их простетических групп. Многие бактерии ауксотрофны по определенным витаминам. Например, шигеллы нуждаются в никотиновой кислоте или ее амиде, который входит в состав NAD и NADF, стафилококки и бруцеллы – в тиамине (B₁), входящем в состав пирофосфата. Кроме того, факторами роста для многих бактерий являются фолиевая кислота, биотин, а также гемы – компоненты цитохромов. Последние необходимы гемофильным бактериям, микобактериям туберкулеза и др.

Метаболиты и различные ионы проникают в микробную клетку путем пассивной диффузии, облегченной диффузии, активного транспорта и при участии фосфотрансферазной системы (рис. 12). Два первых пути не требуют энергетических затрат. Облегченная диффузия протекает при участии ферментоподобных белков — пермеаз. Этими путями в клетку переносится ограниченное количество соединений. Большинство метаболитов, ионов и других веществ транспортируется в клетку активным путем с помощью специфических пермеаз, локализованных в цитоплазматической мембране. Данный процесс требует энергетических затрат и происходит даже в тех случаях, когда концентрация упомянутых соединений в среде ниже, чем в микробной клетке. При этом каждая пермеаза переносит в клетку только определенную аминокислоту или другое соединение. Фосфотрансферазная система состоит из ферментов I и Hpr, а также набора субстратов, осуществляющих фосфорилирование.

Рис. 12. Проникновение питательных веществ в бактериальную клетку:

Различная длина стрелок указывает на сдвиг равновесия. S – высокая, а s – низкая концентрация растворенных веществ; С – пермеазы; R – белок Hpr; R-ф – фосфо-Hpr; S-ф – фосфатная группа (по: Стейнер Р., 1979)

В процессе переноса может произойти химическая модификация вещества, например фосфорилирование углеводов при участии соответствующих ферментов.

Микроорганизмы синтезируют самые разнообразные ферменты (энзимы). Ферментный состав любого микроорганизма определяется его геномом и является достаточно стабильным признаком. Поэтому определение сахаролитических, протеолитических и других ферментов, образуемых определенными видами бактерий, широко применяется для их идентификации. Вместе с тем многие ферменты (нейраминидаза, гиалуронидаза, коагулаза и др.) способствуют проявлению патогенных свойств у возбудителей некоторых инфекционных заболеваний, поскольку субстратом их действия являются вещества, входящие в состав клеток и тканей организма человека.

Одни ферменты микроорганизмов локализуются в их цитоплазме, цитоплазматической мембране и периплазматическом пространстве, другие выделяются в окружающую среду. На этом основано деление ферментов на экзо- и эндоферменты. Экзоферменты расщепляют макромолекулы в окружающей среде до более простых соединений, которые затем транспортируются в микробную клетку. Некоторые ферменты, локализованные в цитоплазме, функционируют независимо друг от друга, другие тесно связаны между собой, обеспечивая протекание метаболических реакций в определенной последовательности. Внутриклеточные ферменты, объединенные структурно и функционально, например ферменты дыхательной цепи, локализованные на цитоплазматической мембране, составляют мультиферментные комплексы.

Ферменты, которые постоянно синтезируются в микробных клетках в определенных концентрациях, называют конститутивными. К ним относятся ферменты гликолиза. Ферменты, концентрация которых резко возрастает при наличии соответствующего субстрата, называют индуцибельными (индукция субстратом). К ним относятся ферменты транспорта и катаболизма лактозы – галактозидпермеаза; β-галактозидаза и галактозидацетилтрансфераза; фермент, разрушающий пенициллин, – β-лактамаза. В отсутствие субстрата они находятся в бактериальной клетке в следовых концентрациях, а при наличии соответствующего индуктора их количество резко возрастает.

Функциональная активность ферментов и скорость ферментативных реакций зависят от условий, в которых находится данный микроорганизм, и прежде всего от температуры и pH среды. Для многих патогенных микроорганизмов оптимальными являются температура 37 °C и pH 7,2 – 7,4.

3.4. Биосинтез углеводов, аминокислот и липидов

Микроорганизмы синтезируют моно-, олиго-, полисахариды и другие соединения, в состав которых входят углеводы. Автотрофы синтезируют глюкозу из углекислого газа (CO₂) атмосферного воздуха. Гетеротрофы синтезируют глюкозу из углеродсодержащих соединений с длиной цепи C₂– C₃. В обоих случаях используются в основном реакции гликолиза, идущие в обратном направлении.

Большинство прокариот способны синтезировать все аминокислоты из пирувата. Источниками энергии являются молекулы АТФ. При образовании аминокислот азот вводится в молекулу предшественника на последних этапах биосинтеза при помощи реакций аминирования и переаминирования. Переход неорганического азота в органический происходит через ионы аммония, которые включаются в состав органических соединений. Только несколько аминокислот (L-аланин, аспартат и L-глутамат) образуются путем прямого аминирования, остальные – путем переаминирования.

Вместе с тем многие микроорганизмы могут получать аминокислоты из молекул белка, которые предварительно расщепляются ими с помощью протеаз и пептидаз. Образовавшиеся олигопептиды и аминокислоты переносятся в микробные клетки, где включаются в метаболические пути биосинтеза или подвергаются дальнейшему расщеплению. Ауксотрофные по некоторым аминокислотам прокариоты (ряд патогенных бактерий, микоплазмы, спирохеты) потребляют их в готовом виде в организме хозяина.

Липиды микроорганизмов представлены жирными кислотами, фосфолипидами, воском, терпенами, каротиноидами, которые содержат длинноцепочечные насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты.

Важную роль в биосинтезе жирных кислот у микроорганизмов играют так называемые ацилпереносящие белки. В ходе биосинтеза к ним присоединяются ацильные фрагменты с образованием тиоэфиров. Последовательное удлинение этих фрагментов приводит в конечном итоге к образованию высших жирных кислот, содержащих обычно 16 – 18 углеродных атомов.

Многие микроорганизмы синтезируют ненасыщенные жирные кислоты с двойными связями, которые формируются из соответствующих насыщенных кислот. У аэробов этот процесс требует присутствия кислорода. Микоплазмы получают жирные кислоты в готовом виде из клеток хозяина или из питательной среды.

Центральную роль в биосинтезе фосфолипидов играет цитидинфосфатглицерид, являющийся непосредственным предшественником фосфатидилглицерина, фосфатидилинозита и фосфатидилглицерофосфата. Остальные фосфолипиды образуются путем ферментативных превращений этих соединений.

3.5. Рост и размножение микроорганизмов

Для роста и размножения микроорганизмов необходимы минеральные соединения, содержащие катионыNH⁺₄,K⁺,Mg²⁺ и др. Ионы аммония используются некоторыми бактериями для синтеза аминокислот, ионы калия – для связывания тРНК с рибосомами. Благодаря значительной внутриклеточной концентрации ионов калия в бактериальных клетках поддерживается высокое осмотическое давление. Ионы магния выполняют роль кофактора в ряде ферментативных процессов. Ионы трехвалентного железа входят в состав цитохромов и других гемопротеидов. Для ряда патогенных и условно-патогенных бактерий (эшерихии, шигеллы и др.) потребление трехвалентного железа в организме хозяина затруднено из-за нерастворимости его соединений при нейтральных и слабощелочных значениях pH. Некоторые микроорганизмы вырабатывают особые вещества — сидерофоры, которые связывают трехвалентное железо и делают его соединения растворимыми и транспортабельными. Бактерии активно ассимилируют анионы SO ₄^2– иPO ₄^3– для синтеза соединений, содержащих эти элементы (серосодержащие аминокислоты, фосфолипиды и др.).

Под термином рост следует понимать необратимое увеличение массы и размеров тела живых существ, для бактерий – увеличение количества клеток и клеточной массы.

Бактерии обычно размножаются бесполым путем – делением. Из одной клетки образуются две, каждая из которых делится в свою очередь. Такое деление при благоприятных условиях может продолжаться бесконечно долго. Вначале делится нуклеоид, затем между двумя будущими клетками образуется перегородка, состоящая из двух слоев цитоплазматической мембраны. Затем между этими двумя слоями появляется материал, из которого образуются два слоя клеточной оболочки. После расслоения клеточных оболочек клетки расходятся.

Грамположительные бактерии делятся посредством образования перегородки, вырастающей от клеточной стенки к центру. У микобактерий перегородка образуется внутри клетки, затем расщепляется на два слоя и разделяет клетку на две. Грамотрицательные бактерии, как правило, истончаются в центре и разделяются перегородкой на две клетки.

Скорость размножения микроорганизмов зависит от состава среды, температуры, условий питания, влажности и ряда других факторов. При благоприятных условиях многие бактерии делятся через 20 – 30 мин.

Недостаток пищи и накопление продуктов распада ограничивают скорость размножения. В проточной среде с непрерывно обновляющимся составом бактерии могут делиться каждые 15 мин. Скорость размножения различных видов бактерий неодинакова даже при наличии тождественных условий. Процесс размножения бактерий в свежей питательной среде включает в себя несколько этапов. Стационарная фаза – период задержки размножения. В этот период, который длится 1 – 2 ч, бактерии, внесенные в свежую питательную среду, не размножаются. Лаг-фаза – приспособление бактерий к новой среде и к последующему размножению в ней. К концу лаг-фазы объем клеток увеличивается. Длительность лаг-фазы зависит как от внешних условий, так и от возраста бактерий и их видовой специфичности. Лаг-фаза развития – время интенсивного логарифмического или экспоненциального размножения. В данный период размножение бактерий идет с максимальной скоростью, а число клеток увеличивается в геометрической прогрессии.

За этими фазами наступает стадия, характеризующаяся постепенным уменьшением количества жизнеспособных бактерий вследствие истощения источников энергии, накопления продуктов метаболизма и других факторов.

Культура бактерий в ограниченном объеме питательной среды называется периодической, и описанные фазы роста характерны именно для таких культур. Если благоприятные для роста бактерий условия поддерживать путем подачи свежей питательной среды и оттока продуктов распада, то их культивирование станет непрерывным. Это происходит при различных биотехнологических процессах.

По типу дыхания риккетсии являются аэробами. Их характерными метаболическими признаками являются: полное окисление глутаминовой кислоты и отсутствие утилизации глюкозы. Риккетсии имеют белковые эндотоксины, чувствительные к формалину.

Рис. 13. Колонии микоплазм

Риккетсии размножаются путем обычного деления кокковидных и палочковидных форм с последующей фазой гомогенных популяций. Другой формой размножения является мицеллярное (как у грибов) дробление нитевидных форм. Нитевидные формы соответствуют наиболее ранней фазе развития риккетсий, а кокковидные и короткие палочковидные формы представляют конечную стадию их деления. Риккетсии размножаются гораздо медленнее, чем бактерии.

Размножение микоплазм не может происходить без участия стерола. Хотя микоплазмы и могут расти на искусственных питательных средах, для своего роста они нуждаются также в холестерине, жирных кислотах и нативном белке. Микоплазмы проникают через водную пленку и адсорбируются агаром. Через 18 ч внутри агара формируются маленькие сферические колонии, через 48 ч эта колония достигает поверхности водной пленки агара. Внешние колонии микоплазм имеют вид яичницы-глазуньи (рис. 13).

Хламидии существуют в двух формах, различающихся по морфологическим и биологическим свойствам. Инфекционной внеклеточной формой является элементарное тельце (ЭТ), а вегетативной, репродуцирующейся, внутриклеточной – ретикулярное тельце (РТ). Элементарное тельце имеет вид сферы диаметром 0,15 – 0,2 мкм, ретикулярное – имеет структуру типичных грамотрицательных бактерий размером около 1 мкм (рис. 14). В ЭТ содержится больше дисульфидных связей, что позволяет им противостоять осмотическому давлению.

Первый этап инфекционного процесса – адсорбция ЭТ на плазмалемме клетки-хозяина. Важную роль здесь играют электростатические силы. Внедрение хламидий происходит путем эндоцитоза. Инвагинация участка плазмалеммы с адсорбированным ЭТ происходит в цитоплазму с образованием фагоцитарной вакуоли. Эта фаза занимает 7 – 10 ч, затем в течение 6 – 8 ч происходит реорганизация ЭТ в вегетативную форму – ретикулярное тельце, способное к росту и делению. Именно в этой фазе эффективно применение антибактериальных препаратов, поскольку ЭТ к ним не чувствительно.

Рис. 14. Цикл размножения хламидий (стадии развития от попадания ЭТ в клетку до выхода ЭТ следующего поколения):

1 – адсорбция элементарного тельца; 2 – проникновение элементарного тельца в клетку; 3 – реорганизация элементарного тельца в ретикулярное тельце; 4 – деление ретикулярного тельца; 5 – созревание ретикулярных телец в элементарные; 6 – накопление ретикулярных телец в эндосоме; 7 – выход хламидий из клетки

Размножение хламидий приводит к формированию включений, известных под названием телец Провачека. В течение 18 – 24 ч развития они локализованы в цитоплазматическом пузырьке, образованном из мембраны клетки-хозяина. Во включении может содержаться от 100 до 500 хламидий. Остановка процесса на этой стадии ведет к персистенции хламидийной инфекции. Далее начинается процесс созревания ретикулярных телец через переходные (промежуточные) тельца в течение 36 – 42 ч развития в ЭТ следующего поколения. Полный цикл репродукции хламидий равен 48 – 72 ч и завершается разрушением пораженной клетки. В случае возникновения для хламидий неблагоприятных метаболических условий этот процесс может затягиваться на более длительный период.

Хламидии могут высвобождаться из инфицированной клетки через узкий ободок цитоплазмы. При этом клетка может сохранять жизнеспособность, этим можно объяснить бессимптомность течения хламидийной инфекции.

Рис. 15. Артроспоры культуры гриба Trichosporon beigelii

Грибы размножаются как половым, так и бесполым (вегетативным) способом. Последний осуществляется с помощью простого митоза. Основные способы размножения:

1) фрагментация гифов мицелия грибов, в результате чего образуются артроспоры (рис. 15); если они образуют толстостенную оболочку, то называются хламидоспорами, высокоустойчивы к действию неблагоприятных факторов внешней среды;

2) почкование, в результате которого образуются бластоспоры;

3) образование бесполых спор, которое у одних грибов происходит в специальных вместилищах (спорангиях) — спорангиоспоры (эндоспоры); у других – на специализированных гифах-конидиеносцах — экзоспоры, или конидии (рис. 16).

Число, форма и размер конидий имеют особую организацию. Некоторые виды способны образовывать различные типы конидий – одноклеточные (микроконидии) либо многоклеточные (макроконидии). Бесполые структуры грибов называются анаморфами, а половые — телеоморфами. Последние наиболее значимы для систематики грибов. Половые стадии обнаружены у совершенных грибов, принадлежащих к классам Ascomycetes и Basidiomycetes, а также у немногочисленных представителей класса Zygomycetes. Процесс созревания половых спор у этих грибов происходит в специальных структурах: у аскоспор – в асках (сумках); у базидиоспор – на (в) плодовых телах.

У представителей класса Zygomycetes продуктом полового процесса, представляющего собой слияние коротких боковых ответвлений вегетативных гифов, являются одноклеточные образования – зигоспоры. Весь жизненный цикл несовершенных грибов (Fungi imperfecti) проходит в гаплоидной стадии. Они размножаются только бесполым путем.

Рис. 16. Морфология грибов рода Rhizopus, класс Zygomycetes

Вирусы не способны к росту и бинарному делению, их размножение тесно связано с клеткой-хозяином. Процесс взаимодействия вирусов с чувствительной клеткой называется репродукцией. Выделяют раннюю и позднюю ее фазы. Ранняя фаза включает: 1) адсорбцию вириона на чувствительной клетке; 2) проникновение в клетку (пенетрацию); 3) раздевание вириона.

Начальные процессы адсорбции имеют неспецифический характер, в их основе может лежать электрическое взаимодействие положительно и отрицательно заряженных группировок на поверхности вируса и клетки. На адсорбцию влияют также рН, буферность и температура среды. При температуре 4 °C адсорбция носит синхронный характер, с повышением температуры скорость адсорбции увеличивается, но она приобретает асинхронный характер. Дальнейшее взаимодействие клеточных рецепторов и вирусных прикрепительных белков носит специфический характер.

Вирусы используют рецепторы, предназначенные для проникновения в клетку необходимых для ее жизнедеятельности веществ: гормонов, ферментов, факторов роста, других питательных веществ. Клеточные рецепторы имеют разную химическую природу. Так, для вируса гриппа и парагриппа рецепторами являются структуры, содержащие сиаловую (нейраминовую) кислоту.

Прикрепление вириона к клеточной поверхности осуществляется следующим образом. Вначале происходит образование единичной связи прикрепительного белка с рецептором – обратимая адсорбция. В этот момент, изменяя рН среды, воздействуя ультразвуком, антителами, можно удалить вирион с поверхности клетки. Для того чтобы наступила необратимая адсорбция, должны появиться множественные связи между вирионами и клеточными рецепторами. Число молекул клеточных рецепторов, участвующих в адсорбции, может доходить до 3000.

Прикрепительные белки вирусов могут находиться в составе уникальных образований, таких, как фибры у аденовирусов. У сложно организованных вирусов эти белки входят в состав шипов на поверхности суперкапсиды, например, у вируса гриппа имеется 300 – 450 шипов гемагглютинина. Просто организованные вирусы содержат прикрепительные белки в составе капсида.

Проникновение (пенетрация) вирусов в клетку осуществляется за счет двух механизмов, взаимодополняющих друг друга: виропексиса (эндоцитоза) и слияния вирусной и клеточной мембраны.

Термин «виропексис», предложенный в 1948 г. Фазекасом де Сан Гро, означает, что вирион попадает в цитоплазму в результате инвагинации участка плазматической мембраны и образования вакуоли. Виропексис является частным случаем рецепторного эндоцитоза, который обеспечивает поступление в клетку аминокислот, нуклеотидов, гормонов и других веществ из межклеточной жидкости. Большинство вирусов проникает в клетку путем рецепторного эндоцитоза, некоторые вирусы – за счет механизма слияния. Функцию белка слияния у вируса гриппа выполняет малая гемагглютинирующая субъединица HA2, у вирусов парагриппа белок слияния — fusion protein (англ. fusiоn – слияние).

Раздевание вируса происходит параллельно с его проникновением. В результате раздевания освобождается внутренний компонент вируса, способный вызвать инфекционный процесс. Раздевание вириона осуществляют ферменты клетки – липазы и протеазы и сопровождается рядом характерных особенностей: вирион теряет инфекционную активность, появляется чувствительность к нуклеазам, возникает устойчивость к нейтрализующему действию антител и др. Раздевание вириона осуществляется постепенно. Так, вирус гриппа вначале теряет липопротеиновую оболочку, на втором этапе удаляется М-белок и освобождается нуклеокапсид.

Прионы присоединяются к внешней поверхности мембраны N-терминальной последовательностью и путем эндоцитоза проникают в клетку. Для накопления PrP^Sc в клетке необходим нормальный PrP^C. Животным, лишенным гена PRNP, не передается прионная инфекция, при увеличении же количества молекул белка PrP возрастает вероятность перехода какой-нибудь из них в патогенную форму. Пониженная инфекционность «чужого» приона при межвидовом заражении объясняется, по всей вероятности, сниженной способностью белка PrP^Sc передавать свое патогенное состояние белку PrP^C, несколько отличающемуся от него по первичной структуре. Белок PrP^Sc в клетке вызывает преобразование PrP^C в патологическую изоформу за счет изменения конформации с разрушением альфа-спиралей и образованием бета-тяжей, возможно, с участием пока не идентифицированного белка, который может взаимодействовать с PrP^C и стимулировать его превращение (такие белки называют шаперонами). Под влиянием одной молекулы PrP^Sc происходит трансформация одной молекулы PrP^C в ее инфекционную форму PrP^Sc, далее процесс накопления инфекционного белка носит лавинообразный характер (рис. 17). Эффективность трансформации определяется видовой гомологией PrP^C и PrP^Sc и, следовательно, снижается в условиях гетерологичной системы животное – человек.

Белок PrP^C синтезируется в эндоплазматической сети и быстро расщепляется К-протеазой, период его полураспада составляет 5 – 6 ч. Синтезированный PrP^C проходит через аппарат Гольджи на поверхность клетки и связывается с гликозилфосфатидилинозитолом. Далее он переносится вдоль аксона при помощи быстрого антероградного транспорта.

Рис. 17. Процесс накопления молекул инфекционного прионного белка

Патологический белок более устойчив к клеточным протеазам и избегает клеточного метаболизма, накапливаясь в структурах лизосом и аппарата Гольджи. Повреждение лизосом вызывает аутокатализ нейрона, после гибели которого PrP^Sc заражает соседние клетки и откладывается в амилоидных бляшках. Накопление PrP^Sc всинаптических структурах и связанная с этим дезорганизация синапсов часто являются причиной развития неврологических нарушений и деменции.

Систематика занимается всесторонним описанием видов микроорганизмов, выяснением родственных отношений между ними, объединением их во взаимосвязанные и взаимоподчиненные группы (таксоны) и, в итоге, составлением естественной классификации микроорганизмов. Таксономия (от греч. taxis – расположение по порядку) является теорией систематики. Оба термина используются как равнозначные. Систематика состоит из трех частей: 1) номенклатуры (правил присвоения названий таксонам и список этих названий); 2) классификации (распределения микроорганизмов по таксономическим группам); 3) идентификации (определения вида бактерий).

Международный комитет по систематике бактерий издает «Международный кодекс номенклатуры бактерий», «Список одобренных названий бактерий» и «Дополнения» к нему.

Микробиология как наука возникла раньше, чем генетика. Поэтому систематика бактерий базировалась исключительно на изучении их фенотипических признаков. На основе методов феносистематики сформировалась традиционная классификация бактерий. Феносистематика изучает таксономические признаки микроорганизмов, т. е. любые признаки, по которым можно установить сходство и отличие классифицируемых групп микроорганизмов.

К таксономическим признакам относятся:

• морфология бактерий;

• подвижность;

• спорообразование;

• культуральные особенности;

• тинкториальные свойства (отношение к окраске по Граму);

• физиологические свойства (типы метаболизма, спектры ферментации или утилизации субстратов, отношение к кислороду);

• антигенная структура микроорганизмов;

• химический состав бактерий (жирнокислотный и липидный состав, белковые спектры и др.);

• чувствительность к бактериофагам и антибиотикам.

Вместе с тем феносистематика имеет ряд существенных недостатков:

• субъективность выбора изучаемых признаков и их оценки;

• зависимость проявления признаков от условий их изучения (фенотипическая изменчивость);

• малая информативность (фенотипически проявляется 5 – 20 % информации генома).

Для повышения информативности и объективности исследования в конце XX в. была создана численная (нумерическая) таксономия. В настоящее время она реализуется на основе компьютерных технологий и должна отвечать двум требованиям: признанию всех таксономических признаков равноценными и изучению максимально большого числа признаков.

Это позволяет применить математический подход к выявлению таксонов и устанавливать степень родства между ними по количественным показателям. Числовая таксономия применяется в научных исследованиях, а в практической работе проводят идентификацию микроорганизмов по ограниченному набору (20 – 30) ключевых таксономических признаков.

Более объективной является естественная (филогенетическая) классификация бактерий, основанная на методах геносистематики. Фенотип и генотип – неразрывные составляющие организма как целого, поэтому методы фено- и геносистематики тесно взаимосвязаны. Геносистематика изучает организацию геномов, т. е. генетические программы организмов. Объект ее исследования – ДНК клетки. Первый метод геносистематики, разработанный в 1957 г. отечественными учеными А. Н. Белозерским и А. С. Спириным и сотрудниками Института Пастера в Париже (К. Ли, Р. Вейлем, Е. Барбю), состоял в определении гуанин-цитозинового коэффициента (соотношения молярных процентов гуанина и цитозина) нуклеотидного состава суммарной ДНК микроорганизма по температуре плавления ДНК или спектрофотометрически. В настоящее время в геносистематике используются методы, позволяющие выявлять родство микроорганизмов на различных таксономических уровнях и изучать их эволюционные связи. К методам генетического анализа относятся:

1. Молекулярная гибридизация ДНК-ДНК (метод выявления гомологии ДНК) позволяет выявить родство на уровне вида и рода. При степени гомологии 70 % и более бактерий относятся к одному геновиду.

2. Молекулярная гибридизация ДНК с рибосомной РНК выявляет родство на уровне рода, семейства.

3. Секвенирование ДНК – определение нуклеотидной последовательности генов или фрагментов (олигонуклеотидов) ДНК позволяет выявлять эволюционные связи на уровне царства, отдела, класса, семейства, рода, но недостаточно чувствителен на уровне вида.

4. Рестрикционный анализ ДНК («фингерпринтинг») позволяет осуществлять внутривидовое типирование бактерий.

4.1. Классификация бактерий

Согласно «Международному кодексу номенклатуры бактерий», научным языком является латинский. Таксономические категории подразделяются на обязательные и необязательные.

Необязательные таксоны (по убывающей):

• подкласс;

• подсемейство;

• триба;

• подтриба;

• подрод;

• подвид.

Обязательные таксоны (по убывающей):

• домен;

• царство;

• тип;

• класс;

• отдел;

• порядок;

• семейство;

• род;

• вид.

Род обозначается одним словом с прописной буквы (существительным в единственном числе); вид – бинарной комбинацией, состоящей из названия рода (с прописной буквы) и видового эпитета (со строчной буквы). При первом упоминании в тексте приводится полное название вида. При повторном употреблении родовое слово сокращается до первой буквы, видовой эпитет сохраняется полностью, например Yersinia pestis и Y. pestis. Видовой эпитет дается произвольно, но чаще по происхождению вида, его особому свойству или в честь ученого, описавшего вид. Обычно видовой эпитет – существительное в родительном падеже, например Shigella sonnei.

Вид может иметь подвиды. Для их обозначения используется тройная комбинация, состоящая из названия рода, видового и подвидового эпитетов. Для разграничения видового и подвидового эпитетов перед последним ставится сокращенное слово subsp. (от лат. subspecies – подвид), например Klebsiella pneumoniae subsp. ozenae. Вид также может иметь разновидности (варианты или вары): серовары, биовары, хемовары и др., например: Salmonella enterica серовар Typhi или S. Typhi. Микроорганизмы одного вида, полученные из различных источников или в разное время, называют штаммами. Им присваивают протокольный номер или номер по источнику выделения. Термином клон обозначают культуру микроорганизмов, полученную из одной клетки. Чистая культура – это популяция микроорганизмов, состоящая из особей одного вида.

Перечень названий всех изученных (опубликованных) видов бактерий представлен в издании Международного комитета по систематике бактерий. В микробиологии до сих пор нет четкого, общепринятого определения такой важнейшей таксономической категории, как вид бактерий. Это обусловлено отсутствием надежных критериев вида у прокариотов. Критерии, используемые для определения вида у растений и животных, не пригодны для бактерий. Можно сказать, что под видом следует подразумевать условную группу микроорганизмов, одинаковых по своим фенотипическим и генотипическим свойствам.

В 1923 г. английский микробиолог Д. Берджи создал первый «Определитель бактерий». Классификация бактерий постоянно совершенствуется, что находит отражение в периодических изданиях «Определителя бактерий».

Среди клеточных форм жизни различают три домена: бактерии, архебактерии (не представляют интереса для медицинской микробиологии) и грибы-эукариоты.

В домен бактерий входят микоплазмы (бактерии, не имеющие клеточной стенки), бактерии с тонкой (грамотрицательные) и толстой (грамположительные) клеточной стенкой. Значение в патологии человека имеют только следующие типы бактерий.

Тип протеобактерий. Класс альфа-бактерий, роды Bartonella, Brucella, Ehrlichia, Orientia, Rickettsia. Класс бета-бактерий, роды Alcaligenes, Bordetella, Burkholderia, Kingella, Neisseria, Spirillum. Класс гамма-бактерий, роды Acinetobacter, Callimatobacterium, Citrobacter, Coxiella, Edwardsiella, Ervinia, Escherichia, Hafnia, Klebsiella, Francisella, Legionella, Pseudomonas, Moraxella, Vibrio, Enterobacter, Morganella, Proteus, Providentia, Salmonella, Serratia, Shigella, Yersinia, Pasteurella. Класс дельта-бактерий, род Bilophila. Класс эпсилон-бактерий, роды Campylobacter, Helicobacter, Wolinella.

Тип фирмикутов. Класс клостридий, роды Clostridium, Sarcina, Peptostreptococcus, Eubacterium, Peptococcus, Veilonella. Класс молликутов, роды Mycoplasma, Ureaplasma. Класс бацилл, роды Bacillus, Sporosarcina, Listeria, Staphylococcus, Gemella, Lactobacillus, Pediococcus, Aerococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Lactococcus.

Тип актинобактерий. Класс актинобактерий, роды Actinomyces, Arcanobacterium, Mobiluncus, Micrococcus, Rothia, Stomatococcus, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Propionibacterium, Bifidumbacterium, Gardnerella.

Тип хламидий. Класс хламидий, роды Chlamydia, Chlamydophila.

Тип спирохет. Класс спирохет, роды Spirochaeta, Borrelia, Treponema, Leptospira.

Тип бактероидов. Класс бактероидов, роды Bacteroides, Porphyromonas, Prevotella. Класс флавобактерий, род Flavobacterium.

4.2. Классификация грибов

Классификация грибов до настоящего времени остается несовершенной и незавершенной. Ранее грибы считали организмами, ближе всех стоящими к растениям, и классифицировали как низшие растения. Основные таксоны, включающие группы грибов, назывались отделами. Большинство грибов, имеющих медицинское значение, относили к формальному отделу Fungi imperfecti. При обнаружении половой стадии развития этих грибов их относили к одному из отделов совершенных грибов (Ascomycota или Basidiomycоtа). Mногие авторы до сих пор придерживаются этой системы классификации грибов.

Достижения последних лет в области молекулярной генетики показали, что «родственные связи» между грибами установить крайне сложно. Царство Mycota объединяет две группы организмов: грибоподобные протоктисты и истинные грибы. Первая группа представлена следующими отделами: Myxomycota, Plasmadiophoromycota, Labyrinthulomycota, Oomycota, Hyphochytriomycota, Chytridiomycota. Вторая группа представлена отделами: Zygomycota, Ascomycota и Basidiomycota, а также «несовершенными грибами». К этой группе относится большинство патогенных и условно-патогенных грибов. Внутри отделов грибы, согласно классификации, разделены на классы, порядки, семейства. Грибы относятся к порядку Actinomycetales, семейству Actinomycetaceae. Отдел Zygomycota включает лишь единичных возбудителей микозов (мукороза и энтомофтороза). Представители отделов Ascomycota и Basidiomycota являются возбудителями микозов, относящихся к III и IV группам патогенности. Ряд представителей диморфных грибов, например Coccidioides immitis, относятся ко II группе патогенности, так как они способны вызывать системные заболевания человека. Такой же уровень биологической опасности имеют некоторые возбудители феогифомикоза (Cladophialophora bantiana), способные поражать мозговую ткань даже у людей с нормальной иммунной системой.

Работа с культурами этих грибов требует специальных условий и особой осторожности персонала микробиологических лабораторий.

4.3. Классификация вирусов

Первые попытки классификации вирусов были предприняты еще в 1940-е годы. Их разделяли по тропизму к определенным тканям: нейротропные – клещевой энцефалит; пневмотропные – грипп; дерматотропные – натуральная оспа, герпес; пантропные – поражающие все ткани человека.

Первые классификации были несовершенны, они основывались на двух признаках: круг поражаемых хозяев (антропонозы и зоонозы), механизм передачи вирусов и место основной локализации. Развитие молекулярной биологии и генетики привело к пересмотру подхода к классификации вирусов.

В 1964 г. А. Львов разработал проект универсальной классификации вирусов. Были учтены определенные критерии, которые легли в основу современной классификации: 1) тип нуклеиновой кислоты; 2) тип симметрии нуклеокапсида (спиральный, кубический, смешанный); 3)наличие либо отсутствие сперкапсида; 4) диаметр нуклеокапсида для спирального типа симметрии и число капсомеров для вирусов с кубическим типом симметрии.

С 1966 г. вопросами классификации занимается Международный комитет по таксономии вирусов (МКТВ). Он состоит из представителей национальных обществ вирусологов. Образованы группы изучения вирусов и разрабатываются рекомендации по их таксономии, которые утверждаются общим собранием и затем Международным конгрессом вирусологов, который созывается 1 раз в 4 года. Решения по изменениям в классификации принимаются коллегиально на основе детального изучения свойств вновь выделенного вируса. Современная классификация универсальна для всех вирусов, известных науке (растений, насекомых, животных, человека). В ее основу положены следующие основные критерии:

• Тип нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), ее структура.

• Наличие суперкапсидной оболочки.

• Размер и морфология вириона, тип его симметрии, число капсомеров.

• Особенности репродукции (в ядре, цитоплазме клетки).

• Феномены генетических взаимодействий.

• Антигенные свойства.

• Круг восприимчивых хозяев.

• Способ передачи вируса.

• Патогенность.

• Географическое распространение и др.

На основании перечисленных признаков вирусы делят на семейства, подсемейства, роды, виды (некоторые вирусы) и типы (серовары). Известно 54 семейства, из них 20 семейств включают вирусы, имеющие медицинское значение (табл. 5). Классификация вирусов до настоящего времени не завершена, продолжается работа по ее совершенствованию.

Таблица 5

Основные семейства вирусов человека и животных

Для упорядочения названий вирусов принят ряд правил. Название семейств оканчивается на «viridae», подсемейств – «virinae», рода – «virus». Прежние видовые названия, в связи с тем что они исторически устоялись, также сохранены.

В качестве примера приведем классификацию вируса гриппа:

1. Род Influenzavirus А, В – виды: вирусы гриппа А и В.

2. Род Influenzavirus С – вид: вирус гриппа С.

У вируса гриппа А есть подвиды: вирусы гриппа А человека, животных и птиц. У вируса гриппа человека имеются сероварианты: H1 N1, H2 N2, H3 N2. У сероварианта H1 N1 — подсероварианты: H1 N1, H0 N1, Hsw1 N1.

Ниже приведены краткие характеристики основных семейств вирусов.

Название происходит от лат. рarvus – мaленький. Самые мелкие вирусы, их размеры лежат в пределах 20 нм. Семейство включает:

• род Parvovirus – могут вызвать поражение клеток красного костного мозга человека и теплокровных животных;

• род Dependovirus – аденоассоциированные вирусы, размножаются только в присутствии аденовирусов, так как сами дефектны; вызывают: ОРЗ, бронхиты, конъюнктивиты, энтероколиты.

Термин «папова» образован от первых слогов следующих терминов «ПАпиллома», «ПОлиома» и «ВАкуоль». В настоящее время роды Papillomavirus и Polyomavirus выделены в отдельные семейства. Род Рapillomavirus – вирусы бородавок человека. Род Polyomavirus – вызывают опухоли у животных.

Впервые были выделены из ткани удаленных аденоидов (отсюда и название семейства). Аденовирусы разделены на два рода:

• род Mastadenovirus – включает 1 – 49-й типы аденовирусов человека;

• род Aviadenovirus – аденовирусы птиц.

Вирусы радужности насекомых. Для человека патогенен вирус африканской лихорадки свиней.

Вирусы герпеса (от греч. herpes – ползучая), более 70 представителей, поражают человека, обезьян, многие виды животных, грызунов, птиц, земноводных, 8 вирусов данного семейства патогенны для человека.

1. Подсемейство Alnhaherpesvirinae включает три рода. 1-й род – вирусы герпеса человека 1-го и 2-го типов. ВГЧ (вирус герпеса человека) 1-го типа вызывает герпес на губах, коже лица. ВГЧ 2-го типа – половой герпес. Персистирует в спинных ганглиях и дает соответствующие рецидивы. ВГЧ 1-го типа также может вызывать половой герпес при орально-генитальных контактах.

В состав ВГЧ 3-го типа входят вирусы ветряной оспы, опоясывающего лишая (варицелла). У взрослых вызывают межреберную невралгию, межреберный опоясывающий лишай (Zoster). Персистирует пожизненно в грудном отделе спинного мозга.

До 90 % людей являются носителями ВГЧ 1 – 3-го типов, но далеко не у всех в течение жизни могут быть клинические проявления. Роды 2-й, 3-й включают вирусы герпесов животных.

2. Подсемейство Betaherpesvirinae включает 2 рода. Род 1 – цитомегаловирус человека (ВГЧ 4) состоит из 2 серовариантов. Названы они по морфологическим изменениям в поражаемых клетках. Вызывают цитомегалию – заболевание, при котором в моче, слюне, тканях появляются характерные гигантские клетки. Вирус персистирует пожизненно. При тяжелых операциях, стрессах, физических нагрузках он активируется и вызывает иммунодефицитные состояния. Род 2 – вирусы животных.

3. Подсемейство Ganumaherpesvirinae. Для медицины имеет значение вирус Эпстайна – Барр (ВГЧ 5). Это СПИД-ассоциированные вирусы. У белых людей заболевание протекает легко, в детском возрасте (у детей 2 – 10 лет) – в виде инфекционного мононуклеоза с выздоровлением; у азиатов – возникает злокачественная назокарцинома; у африканцев – лимфома Беркитта (множественное поражение лимфоидной ткани с большой смертностью).

Другой представитель данного подсемейства ВГЧ 6 – В-лимфотропный вирус человека HBLV. У детей – это причина внезапной экзантемы и небольшой лихорадочной реакции. У взрослых – яппи-синдром (болезнь менеджеров) – хроническая усталость молодых людей. Разрушаются нейроны головного мозга, что приводит к нарастанию усталости, снижению работоспособности, снижению памяти, распаду интеллекта и личности.

Название происходит от aнгл. pox – язвы, пустула. Семейство состоит из двух подсемейств.

1. Подсемейство Chordopoxvirinae – вирусы оспы позвоночных – включает 6 родов:

• Orthopoxvirus – истинные вирусы оспы (вирус натуральной оспы, осповакцины, оспы животных);

• Parapoxvirus – вирусы оспы животных;

• Avipoxvirus – вирусы оспы птиц;

• Capripoxvirus – вирусы оспы овец;

• Leporipoxvirus – вирусы фибромы и миксомы кроликов;

• Suipoxvirus – вирусы оспы свиней.

2. Подсемейство Entomopoxvirine – вирусы насекомых.

Это ДНК-геномные вирусы, поражающие печень. В это семейство входят вирусы гепатита В человека, гепатита пекинской утки, земляного сурка, лесной белки.

Второе подцарство – РНК-вирусы; включает в себя следующий ряд семейств.

Это семейство представлено мельчайшими РНК-геномными вирусами и включает.

1. Род Enterovirus (место первичной репродукции в кишечнике) включает:

• полиовирусы 1, 2, 3-го типов (серовариантов), которые вызывают полиомиелит;

• вирусы Коксаки А 1 – 24;

• вирусы Коксаки В 1 – 6;

• вирусы ЕСНО 1 – 9, 11 – 27, 29 – 34 (энтеропатогенные цитопатогенные человеческие вирусы «сиротки»);

• энтеровирусы человека 68 – 73 (диарею вызывают только 69 – 70, остальные поражают мышцы, плевру, вызывают бронхопневмонию, но при этом размножаются в кишечнике).

2. Род Hepatovirus, содержащий вирус гепатита А.

3. Род Rhinovirus, вызывающий заразный легко протекающий насморк у детей (100 серовариантов, перекрестного иммунитета нет).

4. Род Cardiovirus – для человека нет патогенных вирусов.

5. Род Aphtovirus — возбудитель ящура (может вызывать заболевание и у человека).

Название происходит от лат. сalex (чашка). Под электронным микроскопом видно чашевидное углубление в центре капсида.

Данное семейство включает вирусы гастроэнтеритов человека и HVE – вирус гепатита Е.

Название происходит от лат. toga (мантия, накидка). Семейство включает 3 рода.

1. Род Alphavirus – 25 арбовирусов (вирусы венесуэльского, восточного и западного энцефаломиелитов лошадей).

2. Род Rubivirus – вирус краснухи (не арбовирус, передается воздушно-капельным путем и через плаценту).

3. Род Pestivirus – вирус чумы свиней и других млекопитающих.

Название происходит от лат. flavus (желтый). В семейство входят 27 вирусов, передающихся комарами. Одни вызывают желтую лихорадку, другие – энцефалиты (японский, Сент-Луис); 12 видов передаются клещами (Повассан, Лангат, клещевого энцефалита); у 18 вирусов переносчик не установлен. Сюда же включен и род Hepacivirus (вирус гепатита С).

Название происходит от лат. retro (обратный). Вирусы содержат РНК-зависимую ДНК-полимеразу (обратную транскриптазу).

1. Подсемейство Oncovirinae – онковирусы. Роды А, В, С, D – вирусы животных. Для человека патогенны HTLV I, II (сероварианты), вызывают Т-лимфолейкозы с летальным исходом.

2. Подсемейство Lentivirinae (медленный) – медленные инфекции: меди, висна, вирусы иммунодефицита животных и человека (ВИЧ I и II).

3. Подсемейство Spumavirinae (пенящий) – выделяются после трансплантации, дают характерное ЦПД (вспенивание культур клеток), но роль в патологии человека не выявлена.

Название семейства дано по местечку в Африке. Данное семейство включает более 100 вирусов.

1. Род Bunyavirus включает 16 антигенных групп – 145 видов. Сюда входит вирус Hantaann — возбудитель ГЛПС – геморрагической лихорадки с почечным синдромом (актуальна для Дальнего Востока, Крыма). Остальные представители – вирусы членистоногих. Передают кровососы тропической зоны.

2. Род Flebovirus – 20 вирусов – возбудителей москитных лихорадок (лихорадка долины Рифт).

3. Род Nairovirus — 6 антигенных групп, 26 вирусов, в том числе вирус ККГЛ (конго-крымской геморрагической лихорадки).

4. Род Uukuvirus (местечко в Финляндии) – 7 вирусов вызывают легкую лихорадку у человека, передают комары.

Вирусы данного семейства находятся рядом с истинными вирусами, поражающими слизистую оболочку.

1. Род Paramyxovirus — вирусы парагриппа человека 1 – 5-го типов и животных.

2. Род Morbillivirus – вирусы кори человека и животных (чумка собак).

3. Род Pneumovirus – RS вирусы человека (респираторно-синцитиальный, образуют синцитий – многоядерные структуры, вызывают ОРЗ).

Название происходит от греч. rhabdos (прут). Семейство включает:

1. Род Vesiculovirus — ВВС (вирус везикулярного стоматита).

2. Род Lissavirus вызывает бешенство у животных и человека.

У вирусов данного семейства нет суперкапсида, размеры от 80 до 100 нм. Семейство включает:

1. Род Reovirus — реовирусы человека 1, 2, 3-го типов (серовариантов), респираторные энтеропатогенные вирусы-«сиротки».

2. Род Rotavirus – вирусы человека и животных; вызывают гастроэнтериты, диареи у детей, подростков, молодых солдат.

3. Род Orbivirus – орбивирусы, 10 антигенных групп, 75 вирусов (вирусы лихорадки Кемерово и Колорадской лихорадки).

Бурно развивающаяся в последние годы молекулярная биология обязана своими выдающимися достижениями микробиологии, которая предоставила ей микроорганизмы в качестве экспериментальных объектов. Важность исследований в области генетики микроорганизмов заключается прежде всего в том, что благодаря им впервые созданы методы управления наследственностью.

В 1865 г. чешский ученый Грегор Мендель открыл существование генов. Однако длительное время считалось, что носителем генов является белок. Микроорганизмы игнорировались как объекты генетических исследований ввиду отсутствия у них полового размножения.

В 1928 г. английский ученый Ф. Гриффитс впервые осуществил трансформацию невирулентных пневмококков в вирулентные (ядовитые). Он заразил белых мышей смесью бактерий, состоящей из убитых нагреванием, следовательно потерявших вирулентность, капсульных пневмококков, и живых бескапсульных невирулентных пневмококков. В контрольных опытах эти группы бактерий, введенные порознь, мышей не убивали. Однако в опытной группе мыши погибли, и из крови их были выделены живые пневмококки, приобретшие капсулу убитых пневмококков. Следовательно, убитые капсульные пневмококки содержали вещество, способное передать признак капсулообразования (вирулентности) живым пневмококкам. В то же время механизм трансформации оставался нерасшифрованным.

В 1944 г. О. Эйвери с группой ученых внесли в культуру бескапсульных пневмококков ДНК, выделенную из капсульных пневмококков, в результате чего бескапсульные пневмококки превратились в капсульные, вирулентные для мышей. Таким образом, на микробном объекте микробиологи сделали фундаментальное открытие в генетике – впервые доказали роль ДНК как носителя генетической информации. В 1953 г. Д. Уотсон и Ф. Крик определили структуру гена, основанную на двойной спирали ДНК. Это открытие показало, каким образом ген выполняет свои три важнейшие функции: 1) непрерывность наследственности – полуконсервативным механизмом репликации ДНК; 2) управление структурами и функциями организма – с помощью генетического кода, использующего запас всего из четырех оснований (букв) – аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г), цитозин (Ц); 3) эволюция организмов благодаря мутациям и генетическим рекомбинациям. Работами Ф. Крика, С. Бреннера, М. Ниренберга, С. Очоа, Х. Кораны с использованием микробных объектов был расшифрован генетический код, показана его триплетность, неперекрываемость и универсальность для всех живых организмов.

В 1972 г. возникла и стала бурно развиваться генная инженерия. Ключевое значение для ее возникновения и управления наследственностью имело обнаружение в 1970 г. Г. Теминым, С. Мизутани, Д. Балтимором у некоторых онкогенных вирусов фермента – обратной транскриптазы (ревертазы, РНК-зависимой ДНК-полимеразы), что позволило получить на матрице информационной РНК копийную ДНК – ген и использовать его в генной инженерии. В биотехнологии, основанной на генной инженерии, широко применяются бактериальные ферменты, плазмидные и вирусные векторы, а также бактерии как основные продуценты биологических продуктов.

5.1. Структурная организация генетической информации

Прокариоты (бактерии) имеют морфологически обособленные клеточные структуры, содержащие генетическую информацию, – нуклеоиды. Нуклеоид состоит из одной свернутой в клубок хромосомы, которая свободно располагается в цитоплазме, но связана с определенными рецепторами на цитоплазматической мембране. Поэтому бактериальная клетка, в отличие от эукариот, гаплоидна, т. е. содержит один набор генов.

В отличие от всех других организмов бактерии обладают уникальным свойством изменять массу своей ДНК, регулируя в зависимости от условий обитания содержание копий своих генов. Это позволяет бактериям регулировать скорость собственного размножения, обеспечивает выживание в окружающей среде, а следовательно, и сохранение вида в природе.

Бактериальная хромосома представляет собой двуцепочечную молекулу ДНК (кольцевую хромосому), содержащую гены, расположенные в линейном порядке. Поскольку длина хромосомы (у E. coli около 1000 мкм) во много раз превышает длину бактерии (1,5 – 3,0 мкм в среднем), хромосома компактно упакована в суперспирализованной форме в виде 12 – 80 петель, связанных с сердцевинной структурой. Геном (совокупность нуклеотидов, содержащихся в хромосоме) и генотип (совокупность индивидуальных генов) у бактерий не однозначны, но близки, так как большинство генов содержится в хромосоме в единственном числе, в отличие от эукариот, содержащих до 30 – 50 % повторяющихся последовательностей нуклеотидов в геноме. Поэтому размеры геномов у бактерий, вирусов, плазмид выражаются либо в молекулярной массе, либо количеством нуклеотидных пар геномной нуклеиновой кислоты, либо количеством генов. Эти значения сопоставимы, так как в среднем каждый ген состоит из 1000 пар нуклеотидов, а масса одного нуклеотида ДНК – 500 дальтон. Так, хромосома E. coli имеет молекулярную массу 2,8 × 10⁹ дальтон, количество нуклеотидных пар равно 3,8 × 10⁶ и содержит 2500 – 3000 генов.

Рис. 18. Сокращенная хромосомная карта E. сoli К-12 (по: Коротяев А., Бабичев С., 1998)

Хромосома бактерии состоит из двух типов генов: структурных (цистронов), кодирующих синтез определенной полипептидной цепи, и регуляторных (или акцепторных), регулирующих активность генов (регуляторы, операторы, промоторы, аттенуаторы, терминаторы и др.). Основной структурно-функциональной единицей хромосомы является оперон. Это группа структурных генов-цистронов, физически сцепленных друг с другом и с геном-оператором, который управляет их выражением. В свою очередь, оперон или их группа находятся под управлением одного гена-регулятора и представляют более сложную структурно-функциональную единицу — регулон.

Гены в хромосоме располагаются линейно, поэтому можно изучать их последовательность и составлять хромосомную (генетическую) карту. Для этого устанавливают время переноса соответствующих генов при конъюгации бактерий. Локализацию генов на хромосоме определяют по времени их переноса, в частности, у кишечной палочки оно составляет от 0 до 100 мин (рис. 18).

В настоящее время основным методом изучения организации геномов микроорганизмов является секвенирование – определение последовательности расположения нуклеотидов в составе ДНК генов. Предварительно с помощью методики клонирования получают большое количество необходимых фрагментов ДНК.

Некоторые гены и группы генов хромосомы бактерий и плазмид бактерий относятся к транспонируемым генетическим элементам, т. е. генетическим структурам, способным перемещаться внутри данного генома или переходить от одного генома к другому, например от плазмидного к бактериальному и наоборот. Транспонируемые генетические элементы представлены IS-элементами и транспозонами. IS-элементы, или вставочные последовательности (от англ. insertion sequence), имеют обычно небольшие размеры, не превышающие двух тысяч пар оснований. Они несут только один ген, кодирующий белок транспозазу, с помощью которой IS-элементы встраиваются в различные участки хромосомы. Их обозначают: IS1, IS2, IS3 и т. д.

Транспозоны (Тп) представляют собой более крупные сегменты ДНК. Они способны встраиваться в различные участки хромосомы или переходить от одного генома к другому. Очень часто транспозоны содержатся в составе R-плазмид. Транспозоны обнаружены также в составе геномов бактерий, плазмид, вирусов. Им принадлежит важная роль в изменчивости и эволюции живой материи. Обозначают транспозоны порядковым номером: Тп1, Тп2, Тп3 и т. д.

У многих бактерий генетическая информация может находиться помимо хромосом в особых дополнительных генетических структурах – плазмидах. Плазмида представляет собой экстрахромосомный генетический элемент, который стабильно наследуется в экстрахромосомном состоянии. Первую плазмиду F-фактор (фактор колициногенности) обнаружил у E. coli в 1925 г. А. Грация. В 1953 г. У. Хейс открыл половую плазмиду, контролирующую конъюгацию у бактерий; в 1963 г. Т. Ватанабе описал R-фактор – плазмиду, контролирующую лекарственную резистентность бактерий. Некоторые ученые относят плазмиды к живым организмам – особому классу вирусов.

Все известные плазмиды представляют собой небольшие, ковалентно-замкнутые в кольцо суперспирализованные молекулы двунитевой ДНК, размеры которых варьируют от 1,5 до 200 МД (от 1500 до 400 000 пар нуклеотидов). Чем больше молекулярная масса, тем сложнее набор генов и многообразнее функции плазмид. Плазмиды содержат гены саморепликации; гены, контролирующие самоперенос или мобилизацию на перенос; другие гены, определяющие специфические функции самой плазмиды. Например, F-плазмиды определяют донорские функции клетки и способность ее к конъюгации; Ent-плазмиды – синтез энтеротоксинов; биодеградативные плазмиды – разрушение различных органических и неорганических соединений.

Для плазмид характерны следующие свойства:

• саморепликация;

• поверхностное исключение (механизм, который не позволяет проникнуть в клетку, уже содержащую плазмиду, другой, родственной ей, плазмиде);

• несовместимость (две близкородственные плазмиды не могут стабильно сосуществовать в одной клетке, одна из них подвергается удалению);

• контроль числа копий плазмиды на хромосому клетки (различают малокопийные –1 – 4 копии и многокопийные – от 12 до 38 копий плазмиды);

• контроль стабильного сохранения плазмид в клетке-хозяине;

• контроль равномерного распределения дочерних плазмид в дочерние бактериальные клетки;

• способность к самопереносу (у конъюгативных плазмид);

• способность к мобилизации на перенос (у неконъюгативных плазмид);

• способность наделять клетку-хозяина дополнительными важными биологическими свойствами, способствующими выживанию бактерий и плазмид в природе.

Плазмиды распространяются среди бактерий двумя способами: по вертикали – путем передачи от родительской клетки дочерним клеткам в процессе клеточного деления бактерий и по горизонтали – путем переноса между клетками в популяции бактерий независимо от клеточного деления. Между бактериальными клетками плазмиды переносятся путем конъюгации, контролируемой tra-опероном плазмиды. В зависимости от наличия этого оперона плазмиды подразделяют на конъюгативные и неконъюгативные.

Классификация плазмид основана на их уникальном свойстве несовместимости, т. е. неспособности родственных плазмид стабильно сосуществовать в одной клетке. Она проявляется после проникновения плазмиды в клетку, уже содержащую близкородственную ей плазмиду. Плазмиды, не совместимые друг с другом, но совместимые с другими, объединяются в одну Inc-группу. Например, у энтеробактерий обнаружены 39 Inc-групп плазмид.

Плазмиды, относящиеся к одной Inc-группе, обладают многими общими признаками. Плазмиды имеют важное медицинское значение, так как контролируют синтез различных факторов патогенности бактерий и их лекарственной резистентности. Общебиологическое значение плазмид состоит в том, что они являются уникальным средством самозащиты бактерий и способствуют сохранению их в природе.

5.2. Передача и реализация генетической информации

Передача генетической информации потомству (вегетативная репликация ДНК) осуществляется у бактерий и плазмид по универсальному механизму – полуконсервативной репликацией ДНК. При этом дочерние клетки получают ДНК хромосомы, у которой одна нить родительская (консервативная), другая нить ДНК вновь синтезирована на ее матрице, что обеспечивает очень точную передачу генетической информации (наследственность). Вегетативная репликация ДНК у бактерий начинается со строго фиксированного сайта хромосомы (oriC), который распознается ферментами, инициирующими репликацию. Она происходит одновременно в двух направлениях и заканчивается в строго фиксированной точке — terminus.Поскольку цепи ДНК непараллельны (если одна нить начинается с 5-го конца, то другая – с 3-го конца), а ДНК-полимераза III синтезирует ДНК только в направлении 5 – 3, репликация происходит на каждой нити по-разному: на одной из расплетенных нитей («прямой», «лидерной») она идет непрерывно, а на другой («отстающей») должна возвращаться, чтобы наращивать нить тоже в направлении 5 – 3, прерывисто, через образование сегментов Оказаки длиной около 1000 нуклеотидов у бактерий (рис. 19).

Скорость репликации ДНК у E. coli при температуре 37 °C соответствует включению 2 × 10³ пар нуклеотидов в 1 с. В репликации ДНК участвует комплекс ферментов, образующих единую структуру — реплисому. Генетический контроль репликации ДНК осуществляет большая группа генов хромосомы.

Рис. 19. Схема вегетативной репликации ДНК (по: Коротяев А., Бабичев С., 1998)

Помимо вегетативного у бактерий имеются конъюгативный и репаративный типы репликации ДНК. Конъюгативная репликация происходит при конъюгативном способе обмена генетическим материалом и контролируется плазмидными генами (tra-оперон). При этом осуществляется достройка второй, комплементарной нити ДНК, передаваемой от донора реципиенту. Репаративная репликация служит механизмом устранения из ДНК структурных повреждений и происходит на заключительном этапе генетической рекомбинации. Она контролируется хромосомными и плазмидными генами.

Информация, содержащаяся в геноме бактерий, расшифровывается, материализуется и реализуется путем биосинтеза белка. Универсальности генетического кода соответствует универсальность его расшифровки и реализации (экспрессии). Однако биосинтез белка у бактерий имеет некоторые особенности на этапе транскрипции. Гены бактерий, в отличие от генов эукариот и вирусов, не содержат интронов, поэтому у бактерий отсутствует сплайсинг при синтезе мРНК. Сплайсинг РНК – процесс, при котором происходит вырезание интронов (некодирующих последовательностей у генов, имеющих интрон-экзонную структуру) из первичных РНК-транскриптов и сшивание экзонов, в результате чего образуется и затем транслируется зрелая мРНК. Отсутствие сплайсинга РНК у бактерий является естественным генетическим барьером в реализации генетической информации эукариот у бактерий (прокариот). Преодоление этого барьера привело к созданию генной инженерии на бактериальных объектах.

Генетическая информация реализуется микроорганизмами весьма «экономно», в соответствии с конкретными условиями их существования. «Работают» (экспресcируются) только гены, необходимые для обеспечения жизнеспособности клетки в данных условиях. Саморегуляция системы генетической информации обеспечивается наличием в ней помимо структурных генов, кодирующих белки и другие макромолекулы, особых последовательностей нуклеотидов (акцепторных или регуляторных генов), не имеющих кодирующих функций, но управляющих работой структурных генов. Как уже упоминалось, совокупность расположенных рядом структурных и регуляторных генов составляет оперон-единицу генетической регуляции. Классической моделью оперона является лактозный оперон. Рассмотрим на примере лактозного оперона кишечной палочки его устройство и способ регуляции активности структурных генов, кодирующих синтез ферментов, участвующих в усвоении лактозы.

Начинается оперон (рис. 20) с «участка прикрепления белка-активатора» – продукта вышестоящего регулона (Сар-белка, без которого РНК-полимераза не может связаться с опероном и начать транскрипцию). Далее на хромосоме расположен промотор – участок распознавания РНК-полимеразой и прикрепления ее, затем следует оператор – участок, с которым связывается особый тормозящий транскрипцию белок-регулятор. После оператора расположены последовательно структурные гены z, y, a, кодирующие соответственно синтез трех ферментов, участвующих в усвоении лактозы: β-галактозидазы, β-галактозидпермеазы и тиогалактозидтрансацетилазы. Заканчивается lac-оперон терминатором — небольшим участком ДНК, служащим стоп-сигналом, прекращающим продвижение РНК-полимеразы и транскрипцию оперона. Вне lac-оперона, на другом месте хромосомы находится особый ген-регулятор, кодирующий непрерывный синтез белка-регулятора.

Рис. 20. Схема функционирования lac-оперона (по: Коротяев А., Бабичев С., 1998) 1 – работа оперона блокирована репрессором; 2 – оперон активно работает, молекулы репрессора инактивированы индуктором

Когда в окружающей среде нет лактозы, белок-регулятор прикрепляется к оперону и препятствует продвижению РНК-полимеразы от промотора к структурным генам, подавляя транскрипцию и, в конечном итоге, синтез ферментов. Лактоза, присутствующая в питательной среде, связывается с белком-регулятором, изменяя его конфигурацию, в результате чего белок-регулятор уже не может прикрепляться к оператору. В итоге «шлагбаум» открыт и РНК-полимераза транскрибирует структурные гены в соответствующие мРНК, на матрице которых синтезируются ферменты, усваивающие лактозу.

Таким образом, лактоза индуцирует синтез ферментов, нужных для ее усвоения. Такие ферменты называются адаптивными, или индуктивными. Рассмотренный тип регуляции активности генов называется негативным, так как в его основе лежит репрессия оперона белком-регулятором. Есть два варианта этого типа регуляции: негативная индукция, которую мы рассмотрели, и негативная репрессия.

В последнем случае в исходном положении белок-регулятор не может связываться с оператором и синтез ферментов идет, а при наличии эффектора, обычно конечного продукта действия анаболических ферментов, белок-регулятор под его воздействием связывается с оператором и синтез ферментов подавляется. Кроме негативного известен также позитивный тип генетической регуляции синтеза белка. Отличие его от негативного типа заключается в том, что белковый продукт гена-регулятора не исключает транскрипции оперона, а, наоборот, активирует ее.

5.3. Изменчивость, ее формы и механизмы

Проявление признаков живых организмов, контролируемых генотипом, зависит от условий существования организма. Совокупность признаков организма в конкретных условиях его существования называется фенотипом. В зависимости от условий микроорганизмы одного генотипа могут иметь различные фенотипы, так как реализуется различная часть генетической информации генотипа или реализация происходит в различном диапазоне нормы реакции генотипа. Смена фенотипов при смене условий существования организма называется модификацией. Иными словами, модификации – это фенотипические различия, вызываемые внешними факторами у микроорганизмов с одинаковой наследственностью.

Отличительными признаками модификации у бактерий являются:

• определенность изменчивости (определенный фактор внешней среды, условий вызывает изменение строго определенного признака);

• общность изменений (изменения признака одновременно у всех или большинства особей генетически однородной популяции);

• обратимость изменений (изменения не наследуются и после прекращения действия внешнего фактора исчезают).

Рассмотрим пример модификационной изменчивости бактерий. При посеве разведенной культуры протея (Proteus vulgaris) на питательный агар через сутки выросли колонии бактерий, каждая из которых окружена зоной роения. После пересева колоний на питательный агар с желчью все колонии выросли через сутки без роения. После пересева этих колоний на исходный питательный агар все выросшие колонии вновь имели зоны роения.

Изменения фенотипа протея на среде с желчью следует считать модификацией, так как при этом присутствуют все три вышеперечисленные отличительные признака.

Возможность модификационной изменчивости бактерий следует постоянно учитывать в практической работе микробиолога. Для точной систематики и идентификации бактерий следует строго соблюдать стандартные (унифицированные) условия изучения их свойств (питательные среды, тесты, реактивы, температуру и другие условия культивирования). Огромное значение в связи с этим приобретают квалификация и опыт лаборанта.

Первоисточником новых генов в природе является мутация (лат. mutatio – изменение генетических структур, имеющихся в клетке в данный момент, которое стабильно наследуется). Различают две группы мутаций: хромосомные аберрации, включающие в себя три типа (изменение числа наборов хромосом, изменение числа отдельных хромосом, перестройки хромосом), и генные мутации. У бактерии могут быть мутации типа перестройки хромосом и генные мутации. При этом перестройки хромосом осуществляются путем делений (выпадения фрагмента хромосомы), инверсии (поворота участка хромосомы на 180°), транспозиций (вставок в какое-либо место хромосом небольших фрагментов ДНК, например инсерционных сегментов или транспозонов).

Генные мутации бывают односайтовые (в одном участке гена) и многосайтовые. Для появления мутации в гене достаточно точечного изменения одной пары нуклеотидов. По направлению мутации делятся на прямые и обратные. Прямые мутации вызывают изменения признаков организма дикого типа; обратные мутации сопровождаются реверсией к дикому типу. Восстановление исходного фенотипа в результате обратной мутации в ином участке гена или в другом гене является супрессорной мутацией. Мутация, в результате которой изменяются два и более признаков организма, называется плейотропной. Различают также спонтанные и индуцированные мутации. Спонтанные мутации возникают самопроизвольно в том смысле, что они детерминированы, но мы не знаем конкретно их причин. Индуцированные мутации вызываются воздействием определенных мутагенных факторов. К ним относятся различные виды ионизирующих излучений, ультрафиолетовые лучи, химические мутагены.

Изменчивость по механизму мутаций характеризуется определенными отличительными признаками, к числу которых относятся:

1. Наследственность.

2. Низкая частота (скорость) мутирования (у бактерий 1 × 10⁶ – 1 × 10⁷, т. е. мутация у одной клетки из 1 – 10 миллионов). Способность к мутациям (мутабельность) подвержена влиянию генотипа. У бактерий мутабельность резко повышается при наличии особых генов – мутаторов. Например, у кишечной палочки обнаружены два гена-мутатора – mut T, mut SI.

3. Ненаправленность изменчивости (неопределенность, неадекватность изменения признаков виду воздействующего фактора; один и тот же фактор вызывает различные мутации).

Другим механизмом наследственной изменчивости является обмен генетическим материалом между клетками популяций бактерий (по горизонтали). Он не создает новых элементарных признаков, но ускоряет создание организмов с новыми комбинациями признаков за счет перераспределения генов из разных геномов, способствуя быстрому приспособлению бактерий к условиям среды. Различные виды и роды бактерий способны к широкому генетическому обмену между собой, а также с бактериофагами и плазмидами. У бактерий выявлены три основные формы обмена генетическим материалом: трансформация, трансдукция, конъюгация. Они различаются способом передачи генетического материала.

Под трансформацией подразумевают процесс передачи клетке-реципиенту некоторых генов донора с помощью свободной ДНК, выделенной из генома донора. Трансформация может быть спонтанной или индуцированной. Спонтанная трансформация в естественных условиях проявляется в появлении рекомбинантов при смешивании генетически различающихся клеток. Она протекает за счет ДНК, выделяющейся клетками в окружающую среду при их разрушении или в результате активного выделения ДНК жизнеспособными клетками-донорами.

Индуцированная (искусственная) трансформация происходит при добавлении к культуре бактерий очищенной ДНК, полученной из бактерий-доноров.

Для успешной трансформации необходим ряд условий, относящихся к ДНК и бактериям-реципиентам. ДНК должна быть двуцепочечной, иметь фрагменты массой 3 – 5 × 10⁶ Д, быть частично или полностью гомологичной ДНК реципиента. Клетки реципиента должны обладать компетентностью, т. е. восприимчивостью, что имеет место только в определенный период жизненного цикла и обусловлено выделением клеткой особого белка «фактора компетентности» и специфическим изменением проницаемости клеточной стенки и мембраны.

Процесс трансформации состоит из нескольких этапов: связывания ДНК на поверхности компетентного реципиента с «фактором компетентности», проникновения ДНК путем «втаскивания» в клетку, включения ДНК в хромосому бактерии-реципиента путем рекомбинации, экспрессии переданных генов. Эффективность генетической трансформации во много раз повышается, если смесь ДНК и трансформируемых клеток подвергнуть обработке электрическим импульсом (метод электротрансформации). В естественных условиях эффективность трансформации менее существенна по сравнению с другими формами передачи генетического материала. Клетки бактерий имеют механизм защиты генома от чужеродной ДНК – особые системы модификации и рестрикции. Эти системы защищают свою ДНК путем модификации (чаще путем ее метилирования) и разрушают чужеродную ДНК с помощью особых ферментов – рестрикционных эндонуклеаз. Частным вариантом трансформации является трансфекция, когда в клетку-реципиент, лишенную клеточной стенки, вносят ДНК бактериофага или плазмид.

Трансдукция — перенос генетического материала от клетки-донора клетке-реципиенту с помощью бактериофагов. Различают общую (неспецифическую) и специфическую трансдукцию. Механизм общей трансдукции состоит в том, что в процессе внутриклеточного размножения вирулентного фага в его головку может быть случайно включен вместо фаговой ДНК фрагмент бактериальной ДНК, равной по длине фаговой. Так возникают дефектные фаги, у которых вместо собственной геномной ДНК содержится фрагмент ДНК бактерии-донора. Такие фаги сохраняют инфекционные свойства. Они адсорбируются на бактериальной клетке, вводят в нее ДНК, но при этом размножения фага не происходит. В случае генетической рекомбинации привнесенного фагом фрагмента ДНК донора с хромосомой клетки-реципиента новый признак наследственно закрепляется. Таким образом, при общей трансдукции фаг является только пассивным переносчиком генетического материала.

Специфическую трансдукцию отличает перенос строго определенного фрагмента ДНК бактерии-донора умеренными бактериофагами. Как известно, умеренными называют такие бактериофаги, которые могут интегрировать в хромосому клетки бактерий, вызывая ее лизогенизацию. Под термином «лизогенизация» следует понимать способность различных штаммов бактерий, содержащих бактериофаги, лизировать, или растворять, другие штаммы бактерий, при этом не разрушаясь. Интегрированный в хромосому бактерии-донора умеренный фаг (профаг) в определенных условиях выходит из хромосомы, захватывая ближайшие участки ДНК хромосомы бактерии и оставляя часть своего генома. Возникает дефектный умеренный фаг, включивший в свой геном бактериальные гены бактерии-донора. Далее трансдуцирующий фаг вносит свою ДНК в клетку бактерии-реципиента, где она вместе с фрагментом ДНК бактерии-донора интегрируется в состав хромосомы реципиента. Впоследствии фаг может выйти из хромосомы реципиента, но переданные им гены бактерии-донора остаются у реципиента. Примером может служить умеренный бактериофаг лямбда ( ), который всегда переносит оперон gal или оперон bio. Специфическая и общая трансдукции низкочастотны (10^{– 4}– 10^{– 7} на 1 частицу фага).

Частным вариантом специфической трансдукции является фаговая, или лизогенная, конверсия. Трансдуцирующий фаг, интегрируясь в хромосому реципиента, вызывает лизогенизацию бактерии и передает гены новых признаков, например токсинообразования, дифтерийным бактериям. Однако гены, контролирующие новый признак, постоянно включены в геном таких трансдуцирующих фагов. Появление этих генов не связано с предварительным размножением фага на токсигенных донорах. Вероятно, фаг включил в геном эти гены на более ранних этапах своей эволюции. Такие трансдуцирующие фаги не дефектны и вызывают фаговую конверсию с очень высокой частотой.

Конъюгация характеризуется переносом генетического материала путем непосредственного контакта между клетками. Этот процесс полярен – генетический материал передается только от бактерий-доноров к бактериям-реципиентам. Донорская функция клетки и процесс конъюгации контролируются генами конъюгационного переноса (tra-оперон), локализованными в конъюгативных плазмидах. Среди многих конъюгативных плазмид имеется плазмида F, контролирующая только указанные функции. В автономном, внехромосомном, состоянии она обеспечивает донорский тип клетки F+ (мужская), образование полых ворсинок (F-пили) и свой собственный перенос в F–(женские) клетки реципиента. При этом хромосома донора не передается, а реципиенты, получившие плазмиду F, приобретают донорский тип F+. При интеграции плазмиды F в хромосому бактерии-хозяина образуются Hfr (high frequency of recombination) – штаммы бактерий с высокой частотой передачи хромосомных генов. Однако плазмида F обычно не переходит в клетку реципиента, так как находится на конце хромосомы, противоположном тому, с которого начинается ее переход.

Переход хромосомы через конъюгационный мостик между клетками через канал F-пили сопряжен с ее репликацией. При этом через мостик проходит только одна нить ДНК хромосомы, на которой в клетке реципиента синтезируется комплементарная вторая нить, и далее под контролем генов рекомбинации (rec A) хромосомы реципиента переданный фрагмент ДНК интегрирует в хромосому реципиента. Плазмида F может возвращаться у Hfr-штаммов в исходное внехромосомное состояние, захватив прилегающий участок бактериальной хромосомы. Таким способом формируется плазмида F′ (F-прим), несущая часть хромосомных генов бактерии-хозяина, например плазмида F’lac.

Перенос генов донора в клетки реципиентов посредством плазмид F’ называется сексдукцией. При этом плазмида F’ переносит свой геном, содержащий и некоторые гены донора, с высокой частотой, а хромосома бактерии-донора не передается. Другие виды конъюгативных плазмид (R, Ent, Col и др.) также переносятся с высокой частотой. Следует отметить, что эффективный перенос плазмид путем конъюгации не знает «родственных» барьеров и происходит между бактериями различных видов и родов.

При любой форме обмена генетическим материалом заключительным этапом является рекомбинация между полученной ДНК и хромосомой клетки-реципиента. При переносе одной нити ДНК вначале происходит достраивание комплементарной ей нитью. Рекомбинируют между собой только двунитевые ДНК. Известны общая, сайт-специфическая рекомбинация и рекомбинация, контролируемая транспонируемыми элементами.

Общая рекомбинация происходит между гомологичными ДНК. Сайт-специфическая рекомбинация обусловлена наличием специфических участков у рекомбинируемых молекул ДНК, например, хромосомы E. coli и умеренного бактериофага лямбда. Общая и сайт-специфическая рекомбинации контролируются геном rec A. Рекомбинации, осуществляемые транспонируемыми элементами, также сайт-специфичны и определяются особыми нуклеотидными последовательностями, однако не зависят от rec A гена. Ведущая роль в процессах рекомбинации у бактерий принадлежит гену rec A. Его продукт – белок Rec A (молекулярная масса 38 кД) обладает уникальными функциями: прочно связывается с одиночными нитями ДНК; способствует высвобождению разорванной нити из двойной спирали ДНК; удерживает вместе одиночную нить ДНК и двойную спираль ДНК; обладает свойством ДНК-зависимой АТФазы. Ген rec A участвует не только в процессе рекомбинации. Его продукт необходим для пострепликативной репарации, индукции профага, клеточного деления и других важных функций бактерий. Рецессивные мутации в таком гене отражаются на всех этих функциях, поэтому они получили название SOS-функций, а их совокупность представляет единую SOS-систему. Выражение любой SOS-функции зависит от активности продукта гена rec A. SOS-система срабатывает после любых повреждающих воздействий на ДНК, поэтому ген rec A играет основную роль в самозащите генетической системы бактерий.

5.4. Прикладные аспекты генетики микроорганизмов

Применение методов генетики для изучения генома бактерий позволило создать геносистематику бактерий. На ее основе существенно уточнена действующая классификация бактерий и созданы предпосылки для разработки естественной систематики и классификации. В интересах систематики используют ряд методов. Метод гибридизации ДНК-ДНК выявляет уровень гомологии ДНК. Считается, что показатель 60 – 100 % гомологии ДНК указывает на родство на уровне вида. Метод гибридизации ДНК с рРНК выявляет генетические связи между участком ДНК, контролирующим синтез рРНК, и нуклеотидами рРНК. Цистроны, ответственные за синтез рРНК, консервативны и позволяют выявить родственные связи на уровне рода, семейства.

Наиболее надежным является метод секвенирования ДНК, выявляющий последовательность нуклеотидов в отдельных фрагментах ДНК или всей ДНК хромосомы. Лучшим (наиболее консервативным) объектом исследования является участок ДНК, контролирующий синтез 16S рибосомальной РНК бактерий. ДНК этого фрагмента клонируют, затем секвенируют. Метод секвенирования ДНК является основным в геносистематике; он позволяет выявить родство бактерий на уровне царства, класса, семейства, рода, но недостаточно эффективен для установления вида. Этот метод также помогает установить эволюционные связи бактерий.

Раскрыт генетический механизм весьма важной для медицины проблемы приобретенной лекарственной устойчивости бактерий. Установлено, что основную роль в быстром формировании устойчивости бактерий к антибиотикам играют R-плазмиды, несущие гены устойчивости к 10 антибиотикам в любых сочетаниях. Они могут передавать гены антибиотикорезистентности чувствительным бактериям за несколько минут, превращая в устойчивую всю популяцию бактерий в организме. До сих пор не существует эффективных средств удаления R-плазмид или блокады их передачи. Пока реальным достижением является применение препаратов, блокирующих активность ферментов, разрушающих антибиотики, которые контролируются R-плазмидами. Например, для инактивации бета-лактамазы используют клавулановую кислоту, сульбактам, тазобактам в сочетании с антибиотиками бета-лактамной группы.

Установлен генетический контроль факторов патогенности бактерий. Показана возможность локализации этих генов в геномах бактерий, бактериофагов, плазмид. Выявлены механизмы формирования патогенных штаммов среди условно-патогенных бактерий. Это позволяет выявлять патогенные бактерии молекулярно-биологическими методами и целенаправленно получать авирулентные вакцинные штаммы микроорганизмов.

Крупным достижением в области генетики является разработка метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), отмеченного Нобелевской премией (Мюллис К., 1993). На основе ПЦР создана принципиально новая универсальная система индикации микроорганизмов и диагностики инфекционных заболеваний – геноиндикация. Метод ПЦР позволяет клонировать in vitro определенные участки ДНК, за 2 – 4 ч получить миллионы копий этой ДНК. Сущность метода составляет многократный циклический процесс, попеременно включающий в каждом цикле три этапа: тепловую денатурацию ДНК (плавление), ее отжиг (присоединение синтетических олигонуклеотидных праймеров) и синтез (достраивание второй цепи ДНК термостабильной ДНК-полимеразой). Смена этих этапов происходит в результате изменения температуры реакционной смеси в специальном приборе амплификаторе (термоциклере). Денатурация исходной и последующих копий ДНК, ведущая к разделению ДНК на две одиночные цепи, происходит при температуре 90 – 95 °C в течение 40 – 50 с. Отжиг (присоединение праймеров) происходит при температуре 40 – 65 °C.

Праймеры – синтетические олигонуклеотиды (20 – 30 нуклеотидов) – присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Праймеры подбирают так, чтобы они ограничивали искомый фрагмент и были комплементарны противоположным цепям ДНК; при этом один праймер находится на одной цепи, другой – на противоположной. Синтез (элонгация) – достраивание второй цепи ДНК происходит при температуре 72 °C с участием Taq-ДНК-полимеразы. Достраивание второй нити ДНК идет с 5′-конца к 3′-концу каждой нити ДНК, т. е. в противоположных направлениях. В результате первого цикла образуются две копии участка ДНК, ограниченного праймером. Длительность цикла составляет 30 – 40 с. В результате каждого последующего цикла количество синтезируемых копий удваивается в геометрической прогрессии (рис. 21). Обычно ПЦР включает 20 – 30 циклов, что обеспечивает синтез 1 млн копий искомого фрагмента ДНК.

Рис. 21. Схема полимеразной цепной реакции. Сплошной линией показана исходная ДНК, пунктирной – вновь синтезированная

Для детекции продуктов ПЦР применяется электрофорез в 1,5 – 3 %-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. По окончании электрофореза гель просматривают в УФ-свете на трансиллюминаторе и оценивают результаты.

Метод ПЦР позволяет быстро обнаружить искомый микроорганизм непосредственно в исследуемом материале без выявления чистой культуры, имеет высокую чувствительность (1 × 10¹– 1 × 10³микроорганизмов в 1 г материала). Он широко применяется для обнаружения трудно культивируемых и медленно растущих микроорганизмов (вирусов, хламидий, риккетсий, микоплазм и микобактерий).

В лабораторной практике для индикации и идентификации микроорганизмов используют также метод ДНК-зондов, являющийся разновидностью метода молекулярной гибридизации ДНК-ДНК. Его отличие от последнего заключается в том, что гибридизация ведется не между двумя препаратами тотальной ДНК, а между фрагментами ДНК-зонда (обычно в пределах известного гена) и всей ДНК изучаемого микроорганизма. ДНК-зонды метят изотопами или нерадиоактивной меткой (биотином).

Важное значение в эпидемиологической практике имеют методы внутривидового генетического маркирования штаммов бактерий. К ним относится метод геномной дактилоскопии, или фингерпринтинг (англ. fingerprinting – снятие отпечатков пальцев). Сущность его состоит в рестрикционном анализе ДНК. Очищенную ДНК исследуемого микроорганизма обрабатывают соответствующей специфической эндонуклеазой (рестриктазой), полученные фрагменты ДНК разделяют путем электрофореза в геле. Для каждого исследуемого штамма на электрофореграммах (рестриктограммах) образуется паттерн с характерным набором полос. Число фрагментов, их размер и общая картина расположения специфичны для каждого микроорганизма, как отпечатки пальцев. Сравнивая рестриктограмму контрольного (известного) штамма с рестриктограммой исследуемого штамма, можно определить их тождество или различие. Вариантом метода является риботипирование, когда рестрикции подвергаются участки ДНК, кодирующие рРНК. Метод геномной дактилоскопии позволяет дифференцировать родственные бактерии на внутривидовом уровне.

5.5. Микробиологические основы генной инженерии и биотехнологии

Выдающимся достижением генетики и микробиологии является создание генной инженерии. Генной инженерией называют прикладную генетику, которая разрабатывает методы целенаправленной перестройки геномов и их генетической информации на молекулярном и клеточном уровнях. Она включает в себя совокупность приемов, позволяющих перенести генетический материал из одного организма в другой таким образом, чтобы обеспечить наследование и экспрессию перенесенных генов. Применительно к бактериям генная инженерия использует трансгеноз, то есть искусственный перенос генов (обычно генов эукариот) в клетку бактерий.

Трансгеноз состоит из трех этапов: 1) выделения гена, подлежащего переносу; 2) включения гена в вектор, т. е. в автономно реплицирующуюся генетическую структуру, с помощью которой гены могут быть размножены и введены в клетку-реципиент; 3) передачи вектора с чужеродными генами в клетку-реципиент, где чужеродные гены клонируются (размножаются) в составе хромосом или автономных репликонов и обеспечивают синтез необходимых веществ.

Первый этап. Его задачей является перенос генов эукариот (человека, животных), контролирующих синтез необходимых веществ (гормонов, ферментов) в геном бактерий. Для преодоления генетического барьера между эукариотами и прокариотами предварительно in vitro получают на матрице зрелой информационной РНК соответствующей локализации в ДНК нужного гена с помощью фермента обратной транскриптазы (ревертазы) копийную ДНК (к-ДНК), содержащую ген с нужной информацией. Необходимый ген выделяют из к-ДНК с помощью специфических ферментов рестриктаз (эндонуклеаз). Рестриктазы распознают и разрезают строго определенные участки ДНК так, чтобы срез каждой нити проходил «косо» – на вырезанном двунитевом фрагменте ДНК на концах остаются однонитевые участки («липкие концы»).

Второй этап. Этим же видом рестриктаз обрабатывают молекулы вектора, чтобы перевести их кольцевые структуры в линейные и в местах разреза получить «липкие концы», соответствующие «липким концам» ДНК переносимого гена. В качестве вектора обычно используют R-плазмиды, фаг лямбда. Затем смешивают фрагменты ДНК с нужным геном и ДНК разрезанного вектора. При этом ДНК с нужным геном «липкими концами» встраивается в геном вектора. Места прикрепления гена сшиваются ферментом лигазой. Таким образом получается гибридная молекула вектора с нужным чужеродным геном.

Третий этап. Вектор вводится в клетки бактерий-реципиентов, где он клонируется (реплицируется), передается из клетки в клетку при делении, а чужеродный ген экспрессируется, обеспечивая синтез необходимого продукта. В качестве бактерий-реципиентов чаще всего используют кишечную палочку (рис. 22).

Рис. 22. Схема получения трансгенных клеток E. coli – продуцентов интерферона человека (по: Шапиро Я. С., 2003):

мРНК – интерфероновая мРНК из клеток человека; кДНК1 – комплементарная однонитевая ДНК; кДНК2 – комплементарная двунитевая ДНК; рВR322 – плазмидный вектор; 1 – обратная транскриптаза; 2 – полимераза; 3 – лигаза; 4 – плазмида с геном интерферона; 5 – трансформация; 6 – клетка кишечной палочки с реконструированной плазмидой

Генная инженерия впервые дала возможность человеку управлять наследственностью. Так возникла биотехнология — промышленный способ производства на основе управляемого метаболизма живых организмов. В настоящее время происходит бурное развитие биотехнологии, основным объектом которой являются микроорганизмы. Именно микроорганизмы (бактерии, грибы) благодаря особенностям их метаболизма наиболее продуктивны и экономичны в биосинтезе веществ. Микроорганизмы поставляют также материал для генной инженерии (ревертазу, эндонуклеазы, векторы для генов). Из бактерий получают в большом количестве дешевые биологически активные вещества (гормоны, ферменты), которые ранее были дефицитными и очень дорогими. В нашей стране производятся генно-инженерный интерферон (реоферон), инсулин, интерлейкин-2, вакцина против гепатита В.

Генная инженерия и биотехнология открывают перед человечеством огромные перспективы. Однако даже обычные эксперименты в этой области могут быть опасными, так как при переносе генов могут возникнуть организмы с непредсказуемыми свойствами, поэтому работы по генной инженерии производятся в соответствии со строгими международными правилами.

6.1. Изучение микроорганизмов в окрашенном и живом состояниях

В связи с малыми размерами большинства патогенных микроорганизмов (не более 30 мкм) изучение их морфологии возможно только с помощью специальных оптических приборов, получивших название микроскопов (от греч. «микрос» – малый и «скойпен» – рассматривать, наблюдать).

Современные микроскопы позволяют получать раздельное увеличенное изображение микроорганизмов и других объектов и структур, не доступных невооруженному человеческому глазу.

В настоящее время в практике микробиологических исследований используется несколько типов микроскопов (биологический, люминесцентный, исследовательский, электронный) и специальных методов микроскопии (темнопольный, фазовоконтрастный).

Окрашенные тела микроорганизмов резко отличаются от общего фона препарата, что позволяет установить морфологические особенности микроорганизмов (форму, размеры, наличие спор, жгутиков, капсул) и степень чистоты выделяемой культуры.

Приготовление окрашенного препарата включает в себя несколько последовательных операций: подготовки мазка, высушивания, фиксации, окраски. Вначале обезжиривают предметное стекло и наносят на него каплю изучаемой взвеси микроорганизма. Если мазок получают из бактерий, выросших на плотной питательной среде, то предварительно на стекло наносят каплю физиологического раствора, в которой эмульгируют материал (рис. 23, см. цв. вклейку).

После высушивания мазка на воздухе необходима фиксация. Для этого стекло помещают в сосуд с этанолом или ацетоном (химический способ фиксации) или трижды проводят в пламени спиртовки (физический способ фиксации). Этим достигаются сразу две цели – микроорганизмы погибают и плотно фиксируются на поверхности стекла.

Существуют простые и сложные методы окраски. При простых методах можно использовать только одну краску – водный фуксин (1 – 2 мин) или метиленовый синий (3 – 5 мин). По окончании окрашивания препарат промывают струей воды до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной, и сушат его на воздухе при комнатной температуре, или осторожно промокая фильтровальной бумагой.

Сложные методы окраски предусматривают последовательное использование нескольких красителей различного химического состава, что позволяет выявить определенные структуры бактериальной клетки.

В живом состоянии микроорганизмы исследуют с целью выявления их формы, подвижности или определения прижизненной внутренней структуры. Изучают нативные и окрашенные препараты, используя методы «раздавленной» или «висячей» капли.

В центре влажного препарата быстро возникает недостаточность кислорода. В сущности именно это помогло Пастеру открыть анаэробный обмен: наблюдая за препаратом, он заметил, что анаэробы сохраняли подвижность только в центре, но не по краям. Подвижные микроорганизмы иногда могут адсорбироваться на стекле; в таких случаях подвижность легче наблюдать в «висячей» капле.

При изучении подвижности микроорганизмов необходимо отличать истинную подвижность от броуновского движения, которое является следствием ударов о бактерии движущихся в растворе молекул и выявляется в виде колебаний. Многие подвижные микроорганизмы движутся очень быстро, что затрудняет наблюдение. Добавляя к суспензии микроорганизмов метилцеллюлозу, можно уменьшить скорость их движения и создать условия, при которых движение жгутиков становится видимым.

6.2. Культивирование микроорганизмов на питательных средах

В природе микроорганизмы существуют в смешанной популяции. Для изучения свойств микроорганизмов, определения их систематического положения необходимо прежде всего изолировать отдельные виды микробов и вырастить их в виде так называемых «чистых культур», а затем идентифицировать, т. е. установить их соответствие видам, описанным в специальных определителях (схема).

Культивировать микроорганизмы можно лишь при создании определенных условий для их жизнедеятельности. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть простерилизованы и после посева инокулята (микробного материала), защищены от загрязнения извне с помощью пробок или металлических колпачков и крышек.

Посев инокулята является первым этапом исследования. В практической работе для получения «чистых культур» микроорганизмов используют одну из модификаций метода высева на чашки со средой.

Схема

Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий

Рис. 25. Посев штрихами

Эти методы основаны на том, что отдельные микроорганизмы развиваются на поверхности либо в глубине питательной среды, в которую добавлен агар или какое-нибудь другое гелеобразующее вещество.

Петлю стерилизуют в пламени, остужают и вносят в пробирку с исследуемым материалом. Затем снимают или приоткрывают крышку чашки Петри с питательной средой (рис. 24, см. цв. вклейку) и вносят материал одним из нижеперечисленных способов.

1. Посев петлей: посевной материал втирают петлей в поверхность среды у края чашки, избыток снимают, проколов петлей агар, а оставшийся материал рассеивают параллельными штрихами по стерильной поверхности среды (рис. 25).

2. Посев шпателем: материал наносят на поверхность среды петлей или пипеткой, а затем стеклянным или металлическим шпателем тщательно втирают его по всей поверхности агара. После посева металлический шпатель прокаливают в пламени горелки, а стеклянный помещают в дезинфицирующий раствор.

3. Посев тампоном: тампон с исследуемым материалом вносят в чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в поверхность среды, одновременно вращая тампон и чашку.

4. Посев на секторы: дно чашки расчерчивают на секторы, посев производят зигзагообразными движениями от края чашки к центру так, чтобы штрихи с одного сектора не переходили на другой (рис. 26).

5. Посев газоном: 1 мл исследуемого материала (жидкой бульонной культуры или взвеси микробов в физиологическом растворе) наносят пипеткой и тщательно распределяют по всей поверхности среды. Избыток материала отсасывают пипеткой и вместе с ней помещают в дезинфицирующий раствор.

Рис. 26. Посев секторами

После посева чашки закрывают и переворачивают вверх дном. Надписи на чашках делают со стороны дна, а на пробирках – в верхней части. При выделении чистых культур аэробов можно использовать методы, основанные не только на механическом разобщении бактерий, но и на их различиях по биологическим свойствам. Так, например, некоторые подвижные бактерии могут быстро распространяться по слегка влажной поверхности питательной среды, благодаря этому можно очистить их от неподвижных видов микробов. Иногда при выделении микроорганизмов из природных популяций полезно включить в среду вещества, избирательно подавляющие рост тех или иных микробов. Например, добавляя полиеновые антибиотики (нистатин) в среду, очищают бактериальные культуры, сильно загрязненные грибами.

Посевы инкубируются в термостате 18 – 24 ч. В течение этого времени из отдельных микробных клеток формируются изолированные колонии.

Второй этап исследования – изучение изолированных колоний. Колония – это изолированное скопление микробных клеток одного вида на плотной питательной среде. Строение колоний является важным культуральным признаком при определении вида микроорганизмов, так как каждому виду микробов при росте на определенной плотной питательной среде присуща типичная форма колонии.

Колонии изучают невооруженным глазом в проходящем и отраженном свете и с помощью лупы или под микроскопом при малом увеличении. В проходящем свете их рассматривают со стороны дна чашки; отмечают величину колоний (крупные – от 4 – 5 мм в диаметре и более; средние – 2 – 4 мм; мелкие – 1 – 2 мм и карликовые – меньше 1 мм), их форму (правильная, круглая, неправильная, плоская, сферическая) и прозрачность (рис. 27).

В отраженном свете, рассматривая колонии со стороны крышки, определяют цвет (бесцветная, окрашенная), характер поверхности (гладкая, бугристая, блестящая, матовая), расположение колоний на поверхности среды (выпуклое, плоское, вдавленное).

Обращают внимание на характер краев колоний (ровные, фестончатые, зазубренные), структуру (гомогенная, зернистая, однородная или различная в центре и по периферии).

Важно определить тип колонии. Различают два основных типа колоний бактериальной культуры: а) гладкие – S-тип (от англ. smooth – гладкий), характеризующийся круглой и выпуклой формой, гладкой поверхностью, влажной консистенцией; б) шероховатые – R-тип (от англ. rough – шероховатый), характеризующийся шероховатой поверхностью, неправильными краями, сухой консистенцией. Образуются из гладких S-форм в результате мутации.

Рис. 27. Формы колоний микроорганизмов (по: Шильникова В. К., 2004): а – круглые; б – круглые с фестончатым краем; в – круглые с валиком по краю; г и д – ризоидные; е – с ризоидным краем; ж – амебовидные; з – нитевидные; и – складчатые; к – неправильные; л – концентрические; м – сложные

Помимо этих двух основных типов колоний существует так называемый слизистый М-тип (от лат. mucus – слизистый), характеризующийся тягучей слизистой консистенцией; образуется в процессе диссоциации бактериальных культур. Часть изученной колонии берут для приготовления мазка, который окрашивают и микроскопируют. При подтверждении однородности состава колонии микроскопированием оставшуюся ее часть отвивают на скошенный агар для накопления чистой культуры.

Питательные среды предназначены для накопления, выделения, изучения и сохранения микроорганизмов. При составлении искусственных питательных сред учитывают как потребности микроорганизмов в веществах, необходимых для жизни, так и физико-химические условия, в которых они могут осуществлять обмен между клеткой и средой.

Для обеспечения разнообразных типов метаболизма микроорганизмов питательные среды должны соответствовать следующим требованиям:

1. Они должны содержать все элементы, из которых строится клетка: макроэлементы (углерод, азот, кислород, сера, фосфор, калий, кальций, магний, железо) и микроэлементы (марганец, молибден, цинк, медь, кобальт, никель, ванадий, хлор, натрий, кремний и др.). Все элементы должны находиться в удобоусвояемых конкретным микроорганизмом соединениях. Источником углерода могут быть разнообразные органические соединения: углеводы, многоатомные спирты, органические кислоты, аминокислоты, белки и др. Источником азота служат аммонийные соединения, аминокислоты, пептиды, белки. Источником остальных макроэлементов являются неорганические соединения – соли фосфорной и других кислот. Микроэлементы поступают в питательную среду с органическими субстратами, солями и водой. Витамины (особенно группы В) и другие факторы роста вносят в среду в составе органических субстратов или в виде чистых веществ.

2. Питательная среда должна иметь достаточную влажность (не менее 20 % воды).

3. Концентрация солей в среде должна обеспечивать изотонию, т. е. соответствовать концентрации солей в микробной клетке (для большинства микроорганизмов – 0,5 %; галофильных – 3 %).

4. Концентрация водородных ионов (рН) среды должна быть оптимальной для выращиваемого микроорганизма (диапазон рН 4,5 – 8,5).

5. Окислительно-восстановительный потенциал (Еh) среды должен соответствовать потребностям микроорганизма: для анаэробов 0,120 – 0,060 В, для аэробов – более 0,080 В.

6. Питательная среда должна быть стерильной.

По составу питательные среды могут быть синтетическими и натуральными. Питательные среды являются синтетическими, если содержат только химически чистые соединения в установленных дозировках, т. е. состав их полностью известен. Достоинством таких сред являются стандартность и воспроизводимость. Однако только для немногих патогенных бактерий имеются синтетические среды. Их применяют главным образом для экспериментального изучения метаболизма микробов.

Для практических исследований широко используют натуральные среды. Натуральные (естественные) питательные среды состоят из продуктов животного и растительного происхождения и имеют неопределенный химический состав.

Различают питательные среды общего назначения (универсальные) и специальные. Питательные среды общего назначения пригодны для выращивания многих видов микроорганизмов и служат основой для приготовления специальных питательных сред. К ним относятся, например, мясопептонный бульон, мясопептонный агар, бульон Хоттингера, агар Хоттингера и др. Специальные питательные среды предназначены для избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, изучения их свойств и условий хранения.

Различают следующие виды специальных сред: элективные (избирательные), дифференциально-диагностические, консервирующие. Избирательность питательной среды для определенных видов микробов достигается путем создания для них оптимальных условий (рН, Еh, концентрация солей, состава питательных веществ), т. е. положительной селекцией, или путем добавления в среду веществ (желчи, азида натрия, теллурита калия, антибиотиков и др. ), угнетающих другие микробы, т. е. отрицательной селекцией. Дифференцирующие свойства питательной среды создаются внесением субстрата, к которому определяется отношение микроба (например, сахаров, аминокислот и др.), соответствующих индикаторов (например, рН-индикаторов – бромтимолблау, фуксин; Еh-индикаторов).

По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими (0,2 – 0,7 % агара) и плотными (1,5 – 2 % агара). Сухие питательные среды, выпускаемые промышленностью, получают путем консервации сред.

Для обеспечения микрообъемной технологии биохимической идентификации микроорганизмов выпускаются коммерческие микротест-системы. Они представлены двумя группами, различающимися особенностями содержания субстрата реакции: 1) в питательной среде; 2) в шаблоне-носителе. Тест-системы первой группы содержат в микрообъемных лунках полистироловых пластин дегидрированные питательные среды, стабилизированные поливиниловым спиртом, например, API-20E, Enterotest 1 и 2, отечественные ПБДЕ и MMTE 1иЕ2.Тест-системы второй группы имеют субстрат и индикатор в бумажном или полимерном шаблоне-носителе, например, Micro-ID, Minitek.

Разработаны также тест-системы на основе жидких дифференциальных сред, которые можно изготавливать непосредственно в лабораториях. По результатам биохимических тестов устанавливается вид микроорганизма с помощью таблиц идентификации, аналитического каталога кодов или приборов автоматизированных микробиологических систем биохимической идентификации микроорганизмов. Ввиду ускорения исследования и высокой экономичности микрообъемные тест-системы находят широкое применение в работе лабораторий.

Для натуральных питательных сред используют животные, растительные и микробные продукты: мясо, рыбную муку, молоко, яйца, кровь, картофель, дрожжи и др. Из них готовят полуфабрикаты: настои и экстракты (мясная вода, дрожжевой экстракт), ферментативные и кислотные гидролизаты (пептон, перевар Хоттингера, перевар казеина и др.). Настои и экстракты являются источником факторов роста, гидролизаты – источником аминокислот и других органических питательных веществ.

В качестве уплотнителя питательных сред применяют агар-агар или желатин. Агар-агар – полисахарид, получаемый из морских водорослей. Он способен образовывать в воде гель, плавящийся при температуре 80 – 86 °C и застудневающий при температуре 40 – 45 °C; не расщепляется большинством микроорганизмов. Желатин – белок, получаемый из кожи и костей; желатиновый гель плавится при температуре 32 – 34 °C, застывает при 26 – 28 °C (т. е. при температуре инкубации 37 °C находится в жидком состоянии); расщепляется многими видами микроорганизмов. Поэтому желатин применяют редко.

При необходимости осветляют питательную среду, обрабатывая ее белком куриного яйца, сывороткой или путем осаждения. Разливают среду в колбы, флаконы, пробирки. Если среда подлежит стерилизации при температуре 120 °C, используют чистую нестерильную посуду, а если среда требует стерилизации текучим паром (100 °C) или при температуре 112 °C – стерильную. Закрывают посуду со средой ватномарлевыми пробками с бумажными колпачками. В зависимости от состава среды стерилизуют различными способами. Агаровые среды, не содержащие углеводов и нативного белка, а также синтетические среды стерилизуют в автоклаве при температуре 115 – 120 °C в течение 15 – 20 мин. Среды, содержащие углеводы, молоко, желатин, стерилизуют текучим паром (100 °C) дробно или в автоклаве при температуре 112 °C в течение 15 мин. Среды, содержащие нативный белок, мочевину, стерилизуют фильтрованием или добавляют стерильные компоненты (кровь, сыворотку и др.) в стерильную основу среды. Готовые стерильные питательные среды подвергают контролю на стерильность путем выдерживания в термостате при температуре 37 °C в течение 1 – 3 сут.

Можно готовить питательные среды из сухих (консервированных) порошков. Навеску сухой среды, указанную на этикетке, погружают в дистиллированную или водопроводную воду и кипятят до полного растворения порошка. Затем разливают среду в стерильные колбы, пробирки и стерилизуют. Некоторые среды (например, Эндо, Плоскирева, Левина) можно использовать без стерилизации.

Бактериологическому контролю подлежат все питательные среды промышленного производства и все среды, приготовленные в лаборатории. В качестве тест-культур используют типовые или местные штаммы бактерий, типичные по всем признакам, в гладкой форме. Определяют следующие биологические показатели питательной среды: чувствительность (ростовую), ингибирующие свойства, дифференцирующие свойства, скорость роста бактерий на среде, воспроизводимость.

Чувствительность питательной среды устанавливают исходя из минимального количества колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий, обеспечивающих появление роста колоний на среде, или по максимальному десятикратному разведению культуры из исходной концентрации 10 ед. мутности (по оптическому стандарту мутности Государственного контрольного института им. Л. А. Тарасевича), обеспечивающему появление роста бактерий на всех засеянных чашках Петри. Ингибирующие свойства среды оценивают как степень подавления прочей микрофлоры по величине посевной дозы в КОЕ, полностью подавляемой на среде, или по отношению количества выросших колоний бактерий к расчетному количеству посеянных бактерий.

Дифференцирующие свойства сред изучают путем посева испытуемых видов бактерий в смеси с другими видами с последующим определением четкости дифференциации колоний искомых бактерий. Специфичность дифференцирующего свойства среды выявляют по отсутствию этого свойства у прочих видов бактерий. Скорость роста бактерий (в часах) на среде устанавливают по минимальному времени инкубации посевов, в течение которого обеспечивается четкий, видимый невооруженным глазом рост культуры (для селективных сред) или формирование колоний с типичными дифференциальными признаками. Воспроизводимость биологических показателей сред оценивают по частоте одинаковых результатов (%) при повторных использованиях сред с теми же штаммами бактерий. Контроль различных питательных сред по биологическим показателям проводят по конкретным методикам и нормативам, руководствуясь официальными документами.

Физико-химический контроль питательных сред в лабораториях осуществляют по показателям рН, rH и содержанию аминного азота. Прочие показатели изучают обычно при промышленном производстве питательных сред. Для определения рН и rH сред используют рН-метры, индикаторные бумажки, а также различные химические индикаторы рН и rН, вносимые в питательные среды. Содержание аминного азота изучают методом рН-метрического формолового титрования питательных сред по ГОСТу.

Изучение биохимических свойств выделенных микроорганизмов проводят на третьем этапе. Культуру микроорганизмов, выросшую на скошенном агаре, проверяют на чистоту путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. При этом обращают внимание на форму микроба, величину, расположение клетки. Используя специальное окрашивание выявляют споры, капсулы, включения и жгутики.

Для идентификации культур, т. е. установления вида и типа бактерий, помимо морфологических и культуральных изучают биохимические, антигенные и другие свойства.

6.3. Особенности культивирования облигатно-анаэробных бактерий

Биологические особенности облигатных анаэробов обусловливают необходимость применения специальных методов их культивирования, отличающихся от используемых при работе с аэробными и факультативно-анаэробными микроорганизмами.

Важным условием, которое необходимо соблюдать на всех этапах выделения и идентификации анаэробов, является защита этих микроорганизмов от токсического действия молекулярного кислорода. Время между взятием материала и его посевом на питательные среды должно быть максимально коротким. Для защиты содержащихся в патологическом материале облигатных анаэробов от воздействия атмосферного кислорода используют специальные транспортные среды.

Анаэробные бактерии можно культивировать только на специальных бескислородных питательных средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом (10 – 150 мВ). Для контроля за степенью насыщения этих сред кислородом используют специальные редокс-индикаторы (метиленовый синий, резазурин), восстановленные формы которых бесцветны. При возрастании окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) метиленовый синий окрашивает среды в синий, а резазурин – в розовый цвет, что указывает на непригодность таких питательных сред для культивирования облигатных анаэробов.

Для сохранения низкого ОВП питательные среды должны быть агаризованы. Добавление даже 0,05 %-ного агара повышает их вязкость и уменьшает аэрацию. Для роста облигатно-анаэробных бактерий необходимо использовать только плотные свежеприготовленные питательные среды (не позднее двух часов после приготовления) или прередуцированные (выдержанные в анаэростате не менее суток). Для успешного выращивания анаэробов требуется внесение большого количества посевного материала, в связи с тем что большие концентрации облигатных анаэробов способны быстрее уменьшать ОВП среды и тем самым создавать благоприятные условия для своего роста.

Анаэробный тип дыхания во много раз менее продуктивен, чем аэробный, поэтому питательные среды для анаэробов должны быть более насыщены питательными субстратами и витаминами. В качестве питательной основы они содержат различные экстракты и белковые гидролизаты (сердечно-мозговой и печеночный настои, дрожжевой и соевый экстракты, пептон, триптон, гидролитический перевар казеина и др.), а также гемин, менадион, твин-80, сукцинат натрия, цельную или лизированную кровь. Для выделения различных анаэробов из смеси культур к питательным основам добавляют желчь, азид натрия, антибиотики, налидиксовую кислоту, малахитовый зеленый и другие ингредиенты. В лабораториях для выделения анаэробов из патологического материала чаще всего используют среду для контроля стерильности (СКС), СКС-199, среду Китта – Тароцци, анаэробный кровяной агар (на основе эритрит-агара или агара Д), среду Вильсона – Блера и некоторые другие с соответствующими добавками.

Необходимым условием культивирования анаэробных бактерий является создание анаэробных условий, что достигается с помощью физических, химических, биологических и смешанных методов.

1. Для удаления растворенного в питательных средах кислорода производят регенерацию этих сред путем кипячения в течение 15 – 20 мин на водяной бане. Затем среды быстро охлаждают до 45 – 50 °C.

После посева для предотвращения проникновения кислорода в жидкую питательную среду ее поверхность заливают стерильным вазелиновым маслом или парафином.

2. Посев содержащего анаэробы патологического материала в высокий столбик плотной или полужидкой питательной среды, которая разливается в пробирки в объеме 10 – 12 мл. Кислород воздуха диффундирует обычно на расстояние 1,5 – 2,0 см от поверхности, а в глубине создаются благоприятные условия для роста облигатных анаэробов.

3. Эвакуационно-заместительный метод заключается в удалении воздуха из герметически закрытых сосудов (анаэростатов, анаэробных боксов) с помощью вакуумного насоса с последующей заменой его инертным газом (азотом, аргоном, гелием) или бескислородной газовой смесью, состоящей из 80 % азота, 10 % двуокиси углерода и 10 % водорода. В ряде случаев используют природный (магистральный) газ. Для поглощения остатков кислорода из газовой смеси применяют палладиевый катализатор. Для поглощения водяных паров на дно анаэростата помещают хлористый кальций, силикагель или хлористый натрий.

1. Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в замкнутой воздушной среде. Для поглощения кислорода используют смесь раствора пирогаллола и насыщенного раствора карбоната натрия (Nа₂CO₃).

2. Для поглощения кислорода из замкнутого пространства можно применять гидросульфит натрия.

3. Для связывания остатков кислорода в предназначенных для роста анаэробов питательных средах используют вещества-редуценты, к которым относятся тиогликолевая кислота или тиогликолат натрия, аскорбиновая кислота, различные сахара, цистин и цистеин, муравьинокислый натрий и др.

4. Применение газогенерирующих систем для создания анаэробных условий в замкнутой воздушной среде (микроанаэростатах, эксикаторах, прозрачных газонепроницаемых пластиковых пакетах).

Для образования водорода и двуокиси углерода, необходимых для роста облигатных анаэробов, используют специальные таблетки, которые активируются добавлением воды. Водород, генерируемый таблетками боргидрида натрия, связывает кислород воздуха в присутствии палладиевого катализатора с образованием воды. Углекислый газ вырабатывается при взаимодействии лимонной кислоты с бикарбонатом натрия. Этот метод особенно удобен при работе в полевых условиях.

1. Совместное выращивание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). На одну половину чашки Петри с плотной питательной средой засевают исследуемый материал, а на другую – культуру аэробного или факультативно-анаэробного микроорганизма, способного энергично поглощать кислород. После посева чашку закрывают крышкой, края которой для герметизации заливают парафином или заклеивают пластилином. В качестве активного поглотителя кислорода из замкнутого пространства часто используют культуру Serratia marcescens, которая является своеобразным индикатором качества анаэробиоза. При недостаточной герметизации чашки этот микроорганизм образует ярко-красный пигмент, а при сохранении строго анаэробных условий вырастают бесцветные или бледно-розовые колонии.

2. Помещение в питательную среду кусочков печени, головного мозга, почек и других внутренних органов. При этом тканевые клетки активно поглощают и адсорбируют на себе кислород, в результате чего в среде создаются анаэробные условия. Примером питательной среды, сконструированной по этому принципу, является содержащая кусочки печени среда Китта – Тароцци. К тому же в печеночной ткани содержится большое количество веществ с SH-группой (цистеин, глютатион и др.), обладающих сильным редуцирующим действием.

В большинстве практических лабораторий применяют смешанные методы создания анаэробных условий. Для работы с наиболее чувствительными к молекулярному кислороду анаэробами используют строгую анаэробную технику (метод Хангейта). Метод основан на создании лишенных кислорода питательных сред, воздух над которыми удаляется и замещается бескислородным газом.

Для предотвращения попадания кислорода сосуды с питательными средами закрывают резиновыми пробками. Во время инокуляции анаэробиоз поддерживается за счет постоянного омывания сред потоком бескислородного газа.

6.4. Методы выделения чистых культур облигатных анаэробов

1. Метод Цейсслера. Исследуемый материал рассевают штрихами по поверхности плотной питательной среды, помещают в анаэробные условия и выдерживают в термостате при температуре 37 °C в течение 24 – 72 ч. Изолированные колонии анаэробов пересевают в среду для контроля стерильности (СКС) или среду Китта – Тароцци.

2. Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 0,9 % раствором хлористого натрия, перемешивают и переносят в пробирку с охлажденным сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания последовательно засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают под струей холодной воды. Выросшие через 24 – 72 ч в глубине агара изолированные колонии анаэробов засевают в среду Китта – Тароцци или СКС.

3. Метод Вейона – Виньяля. Готовят разведения исследуемого материала в пробирках с сахарным агаром. Из каждой пробирки разведенный материал насасывают в пастеровские пипетки и запаивают их концы. После получения микробного роста пипетку надпиливают в соответствующем месте, разламывают с соблюдением правил стерильности и переносят изолированную колонию в среду Китта – Тароцци или СКС.

4. Метод Перетца. Готовят разведения исследуемого материала. Содержимое пробирки с соответствующим разведением выливают в стерильную чашку Петри, на дне которой на двух стеклянных или деревянных палочках лежит стеклянная пластинка. Среду заливают сбоку таким образом, чтобы она заполнила все пространство между пластинкой и дном чашки Петри. При появлении микробного роста стеклянную пластинку удаляют, а изолированную колонию засевают в пробирку со средой Китта – Тароцци или СКС для получения чистой культуры.

Наиболее простой и удобной разновидностью метода Перетца является метод «перевернутых чашек». При этом каждое разведение исследуемого материала в пробирке с сахарным агаром заливают в крышку чашки Петри и закрывают ее стерильным донышком чашки, избегая образования пузырей воздуха. Щель между краями крышки и дном чашки Петри заливают расплавленным парафином. Термостатируют при температуре 37 °C до появления изолированных колоний анаэробов.

6.5. Применение лабораторных животных в микробиологии

Биологическими называются методы исследований, проводимых на лабораторных животных. Они дополняют и углубляют данные микробиологического исследования. Целью этих исследований является выделение микроорганизмов из исходного материала, в том числе и загрязненного другими микроорганизмами, а также в тех случаях, когда возбудитель не может быть обнаружен методом посева, например при вирусных и риккетсиозных заболеваниях.

На лабораторных животных определяют вирулентность и токсигенность микроорганизмов, воспроизводят характерную клиническую картину (столбняк), изучают вопросы иммунитета, эффективность биологических и антибактериальных препаратов, получают иммунные сыворотки.

Их используют для выделения вирусов, не вызывающих развития цитопатических изменений в культурах клеток и не размножающихся в куриных эмбрионах: некоторых арбовирусов, вирусов бешенства, ящура, лимфоцитарного хориоменингита и др. Применение лабораторных животных позволяет также по клиническому симптомокомплексу идентифицировать характер вирусной инфекции, ставить реакцию нейтрализации, путем пассажей поддерживать лабораторные штаммы вирусов, сохранять антигенные свойства и активность вирусов, изучать в эксперименте течение вирусной инфекции, получать диагностические и лечебно-профилактические вирусные препараты.

Микробиологические исследования чаще всего проводят на белых мышах, морских свинках и кроликах. Для иммунизации в лабораторных исследованиях используют крыс и кроликов, а на производстве – лошадей, баранов и свиней. Некоторые специальные исследования проводят на кошках, мелком и крупном рогатом скоте и крысах. Из птиц используют кур, гусей, уток. В последние годы чаще применяют новорожденных животных (они более чувствительны к вирусам), «стерильных животных» (извлекают из матки и содержат в стерильных условиях с использованием стерильного воздуха и стерилизованного корма) и животных чистых линий с известной наследственностью (инбредных или линейных).

Имеет значение также вид животного, порода, возраст, масса, пол, упитанность, условия содержания. В опыт берут животных одного вида и возраста и содержат их в одинаковых условиях. Иногда используют разные виды животных, обладающих различной чувствительностью к одному и тому же вирусу, что помогает выявить разнообразные формы инфекции.

Для эксперимента берут только здоровых животных, лучше из одного питомника и одной партии. Температуру тела измеряют в одно и то же время, так как имеются ее суточные колебания. Исследуемый материал вводят с учетом тропизма вирусов к определенным тканям. Так, для выделения нейротропных вирусов материал вводят в мозг, для выделения пневмотропных – через нос (под легким эфирным наркозом).

У лабораторных животных после заражения инфекционным материалом важно своевременно и правильно взять материал для дальнейшего исследования, причем асептически. Результаты выделения вируса считают положительными, если у животного после соответствующего инкубационного периода развиваются симптомы инфекции.

Рис. 28. Внутрибрюшинное заражение белой мыши (по: Лабинская А. С., 1973)

При выборе лабораторного животного необходимо учитывать степень его восприимчивости к изучаемому возбудителю. Так, например, морские свинки восприимчивы к туберкулезу, дифтерии, чуме, сибирской язве; мыши – к туляремии, чуме, ботулизму, столбняку, газовой гангрене и т. д. Каждое лабораторное животное, взятое в опыт, маркируют.

Животных перед опытом необходимо зафиксировать и обязательно обезболить. Для обезболивания чаще всего применяют эфирный наркоз. Для этого морских свинок и мышей помещают на короткое время в закрытую стеклянную банку, на дно которой кладут кусочек ваты, смоченный эфиром. Животным более крупных видов накладывают на мордочку маску с эфиром.

При введении материала в вену кролика или взятии крови животное помещают в специальный деревянный ящик, в передней стенке которого имеется регулируемое отверстие для головы. Можно также запеленать кролика в полотенце, предварительно подогнув лапы к животу.

Способы введения исследуемого материала животным могут быть следующими: подкожный, внутрикожный, накожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, пероральный (через рот), интраназальный (через нос), интрацеребральный (в мозг) и др. Чаще всего в практической микробиологии используется внутрибрюшинный способ заражения (рис. 28).

6.6. Биохимическая идентификация бактерий

Действие протеолитических ферментов, т. е. способность микроорганизмов расщеплять белки, изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном. При посеве уколом в столбик желатиновой среды микробы, разлагающие желатин, разжижают среду. Действие микроорганизмов, разлагающих казеин (молочный белок), проявляется в пептонизации (просветлении) молока, которое приобретает вид молочной сыворотки.

В процессе ферментации пептонов микроорганизмами образуются индол (C₈Н₇N), сероводород (Н₂S), аммиак (NH₃) и другие соединения.

Способность микроорганизмов разлагать сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты, а иногда и газа изучают на средах Гисса. В состав этих сред входят пептонная вода, углевод (моносахариды – глюкоза, ксилоза, арабиноза; полисахариды – крахмал, гликоген), многоатомные спирты (глицерин, маннит, сорбит, инозит) и индикатор. Под действием образующейся при разложении углевода кислоты индикатор изменяет окраску среды («пестрый ряд»). Газообразование определяется по наличию пузырьков газа в толщине полужидких сред или, если среда жидкая, в поплавке (стеклянной трубочке, верхний конец которой запаян).

Сахаролитические свойства изучают и на таких средах, как Эндо, Левина, Плоскирева. В их состав входит молочный сахар – лактоза; при разложении его микроорганизмами до кислоты цвет колонии изменяется соответственно индикатору, находящемуся в среде.

Биохимическая активность микроорганизмов обусловлена их ферментативной деятельностью. Ферменты микроорганизмов являются биологическими катализаторами, определяющими метаболические процессы, протекающие в микробных клетках. Разные виды микроорганизмов нередко отличаются по набору ферментов, которые они способны синтезировать.

Плазмокоагулаза выявляется в пробирочном опыте по определению скорости свертывания испытуемым микробом цитратной кроличьей или человеческой плазмы.

Гемотоксин вызывает лизис эритроцитов. Определяется при посеве испытуемых микробов на кровяной агар. Вокруг колонии наблюдается зона просветления среды.

Лецитиназа разрушает лецитовителлин яичного желтка. Обнаруживается при посеве испытуемых микробов на желточно-солевой агар (ЖСА) по образованию вокруг колоний зоны помутнения с радужным венчиком.

Гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав соединительной ткани. В пробирку с испытуемой культурой внести гиалуроновую кислоту и после 30-минутной экспозиции при температуре 37 °C добавить две капли крепкой уксусной кислоты. При наличии фермента гиалуроновая кислота утрачивает способность образовывать сгусток.

Фибринолизин растворяет фибрин плазмы крови, добавленной к питательной среде.

Учитывая высокую фенотипическую изменчивость бактерий, необходимо использовать для идентификации стандартизованные методики тестов. Желательно использование минимального числа наиболее важных и легко выполнимых тестов. Вначале используют тесты, определяющие принадлежность бактерий к определенному отделу и группе по «Определителю бактерий Берджи», например, морфология, окраска по Граму, подвижность, наличие спор, отношение к кислороду и т. д. Затем применяют наиболее важные тесты, характеризующие предполагаемый таксон (род, вид).

Для идентификации бактерий наиболее важно определение их биохимических признаков, которые устанавливаются преимущественно с помощью микрообъемной технологии с использованием соответствующих таксону коммерческих тест-систем или приборов автоматических систем идентификации. Для идентификации также широко используют серологические реакции, направленные на выявление антигенов бактерий и их таксонов.

Совокупность полученной информации о свойствах бактерий сопоставляют с характеристикой определенных таксонов в «Определителе бактерий Берджи» или других руководствах и дают заключение о таксономическом положении бактерий.

В последние годы все шире применяются методы геноиндикации микроорганизмов, которые не требуют выделения чистых культур: метод ДНК-зондов, полимеразная цепная реакция (ПЦР) со специфическими праймерами.

6.7. Культивирование и выделение вирусов

В отличие от бактерий вирусы размножаются лишь в живых клетках. В связи с этим культивирование вирусов может осуществляться на уровне организма подопытного животного (куриный эмбрион как развивающийся организм относят к подопытным животным) или живой клетки, выращиваемой вне организма, т. е. на уровне культуры клеток.

В тканях куриного эмбриона, его оболочках, желточном мешке способны размножаться многие патогенные вирусы человека и животных. При этом имеет место избирательность вирусов к той или иной ткани: вирусы группы оспы хорошо репродуцируются и накапливаются в клетках хорион-аллантоисной оболочки, вирус паротита – в амнионе, вирусы гриппа – в амнионе и аллантоисе, вирус бешенства – в желточном мешке.

Культивирование вирусов в развивающихся эмбрионах имеет ряд преимуществ перед другими методами: плотная скорлупа довольно надежно защищает внутреннее содержимое от микроорганизмов; эмбрионы восприимчивы ко многим группам вирусов; при заражении куриных эмбрионов получают больший, чем при других методах культивирования, выход вируссодержащего материала; метод заражения куриных эмбрионов прост и доступен любым вирусологическим лабораториям; эмбрионы обладают достаточной жизнеспособностью и устойчивостью к возбудителям внешних факторов.

Однако куриные эмбрионы не всегда свободны от латентных вирусных и бактериальных инфекций. Трудно наблюдать за динамикой патологических изменений, происходящих в эмбрионе после заражения его вирусом. При вскрытии зараженных эмбрионов часто не обнаруживают видимых изменений и выявляют вирус с помощью реакции гемагглютинации и другими методами. В зараженных эмбрионах невозможно проследить за нарастанием титра антител, поэтому данный метод пригоден не для всех вирусов.

Для вирусологических исследований используют эмбрионы 7 – 12-дневного возраста, которые получают из птицеводческих хозяйств. Можно выращивать эмбрионы в обычном термостате, на дно которого ставят лотки с водой для увлажнения воздуха. Температура в термостате должна быть 37 °C, а влажность воздуха – 60 – 65 %. Отбирают крупные, чистые (но немытые), оплодотворенные яйца от белых кур, хранившиеся не более 10 сут. при температуре 5 – 10 °C. Оплодотворенные яйца распознают по наличию зародышевого диска, который при просвечивании с помощью овоскопа имеет вид темного пятнышка.

При работе с вирусами могут быть использованы различные методы заражения эмбрионов, но наибольшее практическое применение получили нанесение вируса на хорион-аллантоисную оболочку, введение в аллантоисную, амниотическую полость и желточный мешок. Выбор метода зависит от биологических свойств изучаемого вируса.

Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона на овоскопе. Живые эмбрионы подвижны, хорошо видна пульсация сосудов оболочек.

При овоскопировании отмечают простым карандашом на скорлупе границы воздушного мешка или место расположения эмбриона, которое определяют по его тени на скорлупе.

Рис. 29. Строение куриного эмбриона (по: Лебедева М. Н., 1973)

Куриные эмбрионы заражают в боксе в строго асептических условиях, используя инструменты, стерилизованные кипячением. При заражении на хорион-аллантоисную оболочку наиболее пригодны 12-дневные эмбрионы (рис. 29). Для заражения в аллантоисную полость используют эмбрионы 10 – 11-дневного возраста, в амниотическую полость – эмбрионы 7 – 11-дневного возраста, в желточный мешок – эмбрионы 7-дневного возраста.

Яйца с зараженными эмбрионами устанавливают на подставках тупым концом вверх. Температурный режим и срок инкубации зависят от биологических свойств инокулированного вируса. Ежедневно жизнеспособность эмбрионов контролируют под овоскопом. Эмбрионы, погибшие в первые сутки после заражения вследствие травмы, не исследуют.

Перед сбором материала эмбрионы охлаждают при температуре 4 °C в течение 18 – 20 ч для сужения сосудов и предотвращения кровотечения при вскрытии. Вскрывают их в боксе с соблюдением правил асептики.

Аллантоисную жидкость насасывают пипеткой, контролируют стерильность путем посева в сахарный или мясо-пептонный бульон, проверяют на наличие вируса в реакции гемагглютинации и хранят при температуре –4 °C (в замороженном состоянии).

Для получения амниотической жидкости вначале отсасывают аллантоисную жидкость, затем пинцетом захватывают амниотическую оболочку, слегка приподнимают ее и пастеровской пипеткой отсасывают амниотическую жидкость.

При изучении изменений на хорион-аллантоисной оболочке ее разрезают ножницами и через отверстие выливают все содержимое в чашку Петри. Хорион-аллантоисная оболочка остается внутри скорлупы и ее извлекают пинцетом и помещают в чашку Петри с физиологическим раствором. Здесь ее промывают, расправляют и изучают на темном фоне характер очаговых поражений.

Для получения амниотической оболочки амниотический мешок, в который заключен эмбрион, разрезают и освобождают от эмбриона, просматривают на наличие поражений.

Для получения желточной оболочки разрезают хорион-аллантоис, отсасывают аллантоисную и амниотическую жидкости, извлекают пинцетом плод, отделяют его за пупочный канатик, захватывают желточный мешок и помещают в чашку Петри, затем контролируют на стерильность, просматривают на наличие поражений. Желток в случае необходимости его извлечения можно отсосать шприцем без выведения наружу желточного мешка.

Наличие вируса в аллантоисной и амниотической жидкостях зараженного эмбриона определяют с помощью реакции гемагглютинации. Жидкости эмбрионов с положительным результатом гемагглютинации после проверки на стерильность соединяют и титруют в развернутой реакции гемагглютинации.

При наличии небольшого количества вируса или невозможности выявить его в исследуемом материале проводят последовательные пассажи на куриных эмбрионах. Если после трех последующих пассажей на эмбрионах в исследуемом материале вирус не обнаруживают, результат считается отрицательным.

Культивирование клеток вне организма требует выполнения ряда условий. Одним из них является строгое соблюдение стерильности при работе, так как используемые питательные среды служат отличным питательным субстратом также для бактерий и грибов. Клетки тканей обладают весьма высокой чувствительностью к солям тяжелых металлов. Поэтому необходимо придавать исключительное значение качеству различных ингредиентов, входящих в состав солевых растворов и питательных сред, а также способам обработки посуды и резиновых пробок, применяемых при культивировании клеток.

Одним из обязательных условий успешной работы с клетками является высокое качество дистиллированной воды (проверяется два раза в неделю). Для работы с клетками используют бидистиллированную или деионизированную воду. Лучшими дистилляторами являются приборы из стекла или легированной стали. Из такой аппаратуры не вымываются ионы тяжелых металлов, являющихся токсичными для клеток. Деионизированную воду получают на специальных установках, где очистка воды от солей осуществляется при ее последовательном прохождении через колонки с анионитом и катионитом.

При культивировании клеток особенно большие требования предъявляются к подготовке и стерилизации посуды и пробок. Во многих случаях именно неправильные их мойка и стерилизация служат причиной неприкрепления клеток к стеклу или быстрой дегенерации клеточного монослоя.

Для роста и размножения клеток вне организма необходим сложный комплекс физико-химических факторов: определенная температура, концентрация водородных ионов, неорганические соединения, углеводы, аминокислоты, белки, витамины, кислород и углекислота, поэтому для культивирования вирусов в культурах клеток используют сложные по составу питательные среды. По характеру компонентов, входящих в их состав, эти среды делят на две группы.

1. Среды, представляющие собой смеси солевых растворов (Хенкса, Эрла и др.) и естественных компонентов (сыворотка крови животных и человека, гидролизат альбумина). Количество каждого из этих компонентов в разных прописях сред различно.

2. Синтетические и полусинтетические среды, состоящие из солевых растворов (Эрла, Хенкса и др.) с добавлением аминокислот, витаминов, коэнзимов и нуклеотидов (среды Игла, 199 и др.). В синтетических средах клетки могут существовать в жизнеспособном состоянии непродолжительное время (до 7 дней). Для более длительного поддержания их в жизнеспособном состоянии, а также для создания лучших условий роста и размножения клеток к синтетическим средам добавляют сыворотку крови животных (коров, телят и др.).

Для выделения вирусов могут быть использованы разные методы культивирования клеток вне организма. Однако в настоящее время наибольшее практическое применение получил метод с использованием однослойных культур первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток. Однослойные культуры клеток выращивают в стеклянных плоскостенных сосудах-матрацах вместимостью 1 л, 250 и 100 мл или в обычных бактериологических пробирках, обработанных соответствующим способом.

Сущность метода с использованием первично-трипсинизированных культур клеток заключается в разрушении межклеточных связей в тканях протеолитическими ферментами и разобщении клеток для выращивания монослоя на поверхности стекла. Источником получения клеток могут служить ткани и органы эмбрионов человека и животных, забитых животных и птиц, а также извлеченные у человека при операции. Используют нормальные и злокачественные ткани, эпителиальные, фибробластического типа и смешанные. Способность к размножению клеток, извлеченных из организма, тесно связана со степенью дифференциации ткани. Чем меньше дифференцирована ткань, тем более интенсивной способностью пролиферации обладают ее клетки in vitro. Поэтому клетки эмбриональных и опухолевых тканей значительно легче культивировать вне организма, чем нормальные клетки взрослых животных.

Таблица 6

Наиболее употребляемые культуры перевиваемых клеток

Культуры ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа для определения характера их роста. Если клетки не пролиферируют, выглядят округлыми, зернистыми, темными и отслаиваются от стекла, значит посуда плохо обработана или токсичны ингредиенты питательной среды.

Наряду с первично-трипсинизированными тканями для культивирования вирусов широко используют культуры перевиваемых клеток, т. е. культуры клеток, способных к размножению вне организма неопределенно длительное время. Наиболее часто применяют культуры клеток, полученные из нормальных и раковых тканей человека. Широкую известность приобрели линия клеток HeLa, полученная из опухоли шейки матки, Нер-2 – из карциономы гортани, КВ – из ткани рака полости рта. Готовят также культуры клеток и из нормальных тканей животных – почки обезьяны, кролика и эмбриона свиньи (табл. 6).

Для пересева перевиваемых клеток питательную среду отсасывают пипеткой и выливают. Сформировавшийся тонкий слой разрушают раствором трипсина, и освобожденные таким образом клетки переносят в новый сосуд со свежим питательным раствором, где вновь образуется монослой клеток.

Индикатором наличия вируса в зараженных культурах клеток могут служить: а) развитие специфической дегенерации клеток; б) обнаружение внутриклеточных включений; в) обнаружение специфического антигена методом иммунофлюоресценции; г) положительная реакция гемадсорбции; д) положительная реакция гемагглютинации; е) образование бляшек.

Рис. 30. Внутриклеточные включения вируса в культуре клеток – тельца Гуарниери (по: Бургасов П. Н. и Николаевский Г. Р., 1972)

Для выявления специфической дегенерации в зараженных культурах клетки ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа. Многие вирусы при размножении в клетках вызывают их дегенерацию, т. е. оказывают цитопатическое действие (ЦПД).

Время развития и характер цитопатических изменений в инфицированных культурах клеток определяются свойствами и дозой инокулированного вируса, а также свойствами и условиями культивирования клеток. Одни вирусы (оспы, полиомиелита, Коксаки В и др.) вызывают ЦПД в пределах первой недели после заражения, другие (аденовирусы, парагриппозные вирусы, ЕСНО и др.) – спустя 1 – 2 нед. после заражения.

Вирусы вызывают цитопатические изменения трех основных типов: образование многоядерных гигантских клеток и симпластов, являющихся результатом слияния цитоплазмы многих клеток; круглоклеточную дегенерацию, возникающую вследствие утраты межклеточных связей и округления клеток; развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток.

При размножении некоторых вирусов в культурах клеток образуются внутриклеточные включения в цитоплазме или ядре пораженных клеток (рис. 30). Культуры клеток для выявления включений выращивают на стеклянных пластинках в пробирках, заражают вирусом и через определенные сроки инкубации готовят препараты, окрашивая их обычными красителями.

Для выявления специфического антигена в зараженных культурах клеток препараты готовят так же, как для выявления включений, используя МФА.

В основе метода бляшек лежит образование в монослое зараженных вирусом клеток под агаровым покрытием обесцвеченных участков, состоящих из дегенерированных (погибших) клеток. Эти участки, получившие название бляшек, представляют собой колонии вируса, образующиеся, как правило, из одной вирусной частицы.

При отсутствии цитопатических изменений, внутриклеточных включений, бляшкообразования, отрицательных реакций гемадсорбции и гемагглютинации в культурах клеток, зараженных исследуемым материалом, проводят два последующих пассажа. При отсутствии указанных изменений в конечном пассаже результат выделения вируса считают отрицательным.

6.8. Обнаружение и идентификация вирусов

Для обнаружения вирусов в инфекционном материале могут быть использованы микроскопические и иммунологические методы.

К микроскопическим относятся вирусоскопия и обнаружение внутриклеточных включений; к иммунологическим – иммунная электронная микроскопия, иммунофлюоресценция, гемагглютинация, гемадсорбция.

Идентификация вирусов осуществляется с помощью иммунологических методов, включающих следующие реакции: а) торможение гемагглютинации; б) задержку гемадсорбции; в) связывание комплемента; г) нейтрализацию; д) преципитацию в геле агара.

Микроскопические методы. С помощью светового микроскопа могут быть обнаружены только крупные вирусы, размеры которых превышают 150 нм. Распознавание вирусов, имеющих меньшие размеры, возможно лишь в электронном микроскопе. Для выявления крупных вирусов может применяться световая, фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия.

При вирусных инфекциях в зараженных клетках развиваются своеобразные включения. Одни инфекции (бешенство, оспенная вакцина) сопровождаются образованием включений в цитоплазме пораженных клеток, другие (корь, натуральная и ветряная оспа, аденовирусные заболевания) – в цитоплазме и ядре. Включения имеют различную природу, структуру, форму и размеры от 0,25 до 25 мкм. Согласно современным данным, при одних инфекциях включения являются местом размножения вируса и представляют собой его скопления, окруженные веществами клетки, при других – продукт дегенерации клетки.

Включения могут быть выявлены в окрашенных отпечатках органов и тканей, соскобах клеток, гистологических срезах из пораженной ткани и препаратах культур клеток, инфицированных вирусом. Окраску чаще производят по методу Романовского – Гимзы. Для окраски этим методом препараты фиксируют в смеси Дюбоска – Бразиля – Буэна, состоящей из пикриновой кислоты, формалина, спирта, уксусной кислоты. Внутриклеточные включения при большинстве вирусных инфекций являются оксифильными и красятся по методу Романовского – Гимзы в розовый или сиреневый цвет.

Иммунологические методы. В последние годы эти методы стали ведущими в лабораторной диагностике вирусных инфекций. Это во многом объясняется экономическими причинами, поскольку классические методы вирусологического анализа довольно дороги. Кроме того, длительность исследований с помощью вирусологических методов (недели), даже если они оказываются вполне эффективными, делают их ретроспективными.

Иммунологические методы используют как для обнаружения вирусных антигенов в различных биосубстратах и объектах внешней среды, так и для серодиагностики – выявления в сыворотках крови больных людей и лабораторных животных антител к вирусным антигенам. Помимо этого иммунологические методы исследования незаменимы при идентификации вирионов.

Взаимодействуя с организмом, вирусы вызывают образование антител, которые, адсорбируясь на вирионах, препятствуют проникновению вирионов в клетки и развитию цитопатического действия (ЦПД); нейтрализуют смертельное действие вирусов при репродукции их в куриных эмбрионах и организме животных; инактивируют вирионные гемагглютинины и нейраминидазы, предотвращая реакцию гемагглютинации (РГА) и реакцию гемадсорбции (РГадс) на пораженных вирусом клетках. Эти вируснейтрализующие антитела вызывают также агглютинацию и преципитацию вирусных частиц, а образующиеся при этом иммунные комплексы связывают комплемент. Поэтому для идентификации вирионов используются классическая реакция нейтрализации (РН) на культурах клеток, куриных эмбрионах и животных и ее модификации: реакция торможения гемагглютинации (РТГА); реакция торможения гемадсорбции (РТГадс). Те же реакции используются в серодиагностике вирусных инфекций для обнаружения в сыворотке больных вируснейтрализующих антител по известному вирусному антигену (диагностикуму).

Метод иммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ). Электронная микроскопия в настоящее время играет важную роль в изучении вирусов. Именно данные электронной микроскопии служат основой современной классификации вирусов.

Новый этап в развитии электронно-микроскопического изучения вирусов – применение техники иммуноэлектронной микроскопии. С помощью этого метода стали возможными не только прямое обнаружение вирусов, но и их идентификация, а также быстрое серотипирование вирусных штаммов и титрование антител к ним. Большое значение ИЭМ приобрела для определения локализации вирусных антигенов внутри клеток макроорганизма.

Несомненным преимуществом ИЭМ является ее высокая чувствительность по сравнению с другими электронно-микроскопическими методами.

При контакте антигена вируса или вирусного компонента с гомологичной антисывороткой формируется комплекс антитело – антиген. Данный феномен является основой методики, употребляемой для обнаружения и идентификации вирусных антигенов или антител к ним. Именно эти комплексы антигенов с антителами после негативного контрастирования можно наблюдать в электронном микроскопе. В клинической диагностике антигенный материал не требует тщательной очистки. Так, в случае выявления вируса гриппа можно исследовать неочищенную аллантоисную жидкость. В настоящее время считается, что практически любой вид клинического материала пригоден для ИЭМ. В диагностических целях можно применять обычную нефракционированную сыворотку, а также сыворотки реконвалесцентов. На конечные результаты большое влияние оказывает соотношение количеств антигена и антител. При избытке антигена наблюдают изобилие частиц; агломераты в данном случае будут немногочисленны. При избытке антител вирусные частицы окружены их толстым слоем, выявить мелкие структурные детали вириона практически невозможно; агрегаты также немногочисленны. При оптимальном соотношении количеств антигена и антител агрегаты укрупняются при хорошем изображении деталей вирионов. В связи с вышеизложенным желательно использовать иммунную сыворотку в нескольких разведениях.

На опорную сетку наносят пленку-подложку, приготовленную из палладия. При использовании низких концентраций палладия и для улучшения адсорбционных свойств подложки ее укрепляют с помощью угля. Для этого на готовую сухую пленку-подложку на электронно-микроскопической сетке напыляют уголь в вакууме. Толщина пленки-подложки и укрепляющего слоя углерода оказывает существенное влияние на изображение мелких деталей объекта. Конкретную толщину пленок-подложек и слоя угля каждый исследователь определяет индивидуально, исходя из того, что углерод более электронно прозрачен, чем палладий.

Вирусы и антитела к ним имеют малую электронную плотность, поэтому биологические объекты невозможно выявлять с помощью электронного микроскопа без предварительной обработки. Для визуализации вирусов используется техника негативного контрастирования (или негативной окраски). Для негативного контрастирования вирусов и комплексов «вирус – антитело» применяют различные соли тяжелых металлов. Контрастирующие вещества (атомы тяжелых металлов) проникают в гидрофильные участки объектов и замещают в них воду. В результате электронная плотность объекта возрастает, становится возможным его наблюдение в электронном микроскопе.

Прямой метод ИЭМ получил наибольшее применение в практике. Вирусную суспензию смешивают с неразведенной антисывороткой. После энергичного перемешивания смесь инкубируют в течение 1 ч при температуре 37 °C, затем в течение ночи – при 4 °C. На следующий день смесь центрифугируют для осаждения иммунных комплексов. Осадок ресуспендируют в капле дистиллированной воды и подвергают негативному контрастированию.

При оценке результатов ИЭМ продукты взаимодействия между антигеном и антителом в электронном микроскопе могут иметь различный вид (отдельной вирусной частицы, покрытой антителами полностью или частично; агломератов вирусных частиц). Агломераты могут занимать различную площадь, иметь различный внешний вид, содержать различное количество частиц. Поэтому, наряду с опытными, необходимо исследовать контрольные препараты (с буферным раствором или гетерологичной антисывороткой).

Критерий оценки результатов, полученных с помощью ИЭМ, – наличие или отсутствие в препаратах скоплений вирусных частиц, агрегированных иммунной сывороткой. Наличие агломератов антигена и антител специфической антисыворотки – признак положительной реакции. Тем не менее следует учитывать возможность неспецифической агрегации частиц антигена под влиянием высокоскоростного центрифугирования. По этой причине многие авторы рекомендуют учитывать результаты по условной шкале от 0 до 4 +. Она основана на оценке степени покрытия агрегированных частиц антителами сыворотки.

Методы гемагглютинации и гемадсорбции. Многие вирусы обладают способностью агглютинировать (склеивать) эритроциты строго определенных видов млекопитающих и птиц. Так, вирусы гриппа и эпидемического паротита агглютинируют эритроциты кур, морских свинок, человека; вирус клещевого энцефалита – эритроциты барана; вирусы японского энцефалита – эритроциты однодневных цыплят и гусей; аденовирусы – эритроциты крыс, мышей, обезьян. В качестве исследуемого материала в реакции гемагглютинации (РГА) используют аллантоисную, амниотическую жидкости, суспензию хорион-аллантоисных оболочек куриных эмбрионов, взвеси и экстракты из культур клеток или органов животных, зараженных вирусами. Реакцию гемагглютинации можно ставить капельным методом на стекле и в развернутом ряду в пробирках или лунках пластин из полистирола. Первый метод является ориентировочным.

Являясь группоспецифической, РГА не позволяет определить видовую принадлежность вирусов. Их идентифицируют с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Для ее постановки используют заведомо известные иммунные противовирусные сыворотки. К каждому их разведению добавляют равное количество вируссодержащей жидкости. Контролем является взвесь вируса. Смесь выдерживают в термостате, затем добавляют взвесь эритроцитов. Спустя несколько минут определяют титр вируснейтрализующей сыворотки, т. е. максимальное ее разведение, вызвавшее задержку агглютинации эритроцитов.

В серологической диагностике вирусных болезней РТГА рекомендуется ставить с парными сыворотками, одну из которых получают в начале заболевания, а другую – спустя 1 – 2 недели и более. Четырехкратное нарастание титра антител во второй сыворотке подтверждает предполагаемый диагноз.

Реакцию гемадсорбции (РГадс) применяют для индикации в зараженных культурах клеток вируса, обладающего гемагглютинирующей активностью. Сущность реакции заключается в том, что на поверхности клеток, зараженных вирусами, адсорбируются эритроциты, чувствительные к гемагглютинирующему действию вирусов. Так, например, на клетках, зараженных вирусом натуральной оспы, адсорбируются эритроциты кур; вирусом кори – эритроциты обезьян; аденовирусами – обезьян и крыс и др. (рис. 31).

Рис. 31. Феномен гемадсорбции (по: Лебедева М. Н., 1973)

Репродуцируясь в культурах клеток, вирусы вызывают разного рода ЦПД, выражающееся в округлении, сморщивании, уменьшении или, наоборот, увеличении размеров клеток, слиянии их и образовании симпластов, деструкции цитоплазмы и ядра. Наконец, в монослое клеток, зараженных вирусами, в результате разрушения ими отдельных участков клеточного пласта могут появляться «стерильные пятна», или бляшки, представляющие собой клон вирусной частицы, что дает возможность не только изолировать вирус, но и определить его титр.

Идентифицировать вирус по характеру бляшек очень трудно, и поэтому прибегают к постановке реакции нейтрализации (РН) выделенного вируса заведомо известными вируснейтрализующими сыворотками. С этой целью полученный от больного вирус накапливают в культуре клеток и различные его разведения смешивают с неразведенной противовирусной сывороткой.

Смесью вирусов и сывороток можно заражать куриные эмбрионы или чувствительных животных. В таких случаях нейтрализующую активность антител чаще всего определяют по нейтрализации вирусных гемагглютининов в жидкостях эмбриона и устранению смертельного действия вируса на эмбрионы и животных. Одновременно вычисляют индекс нейтрализации, выражающий максимальное количество смертельных доз вируса, которое нейтрализуется данной сывороткой, по сравнению с результатами контрольного опыта, принимаемыми за единицу.

Подобным образом с помощью РН идентифицируются вирусы, выделенные из материала больных, при заражении им куриных эмбрионов и животных. Для этого к вируснейтрализующим сывороткам прибавляют вируссодержащие жидкости эмбрионов и взвеси пораженных органов животных. После определенного времени инкубации смесями инфицируют культуры клеток, куриные эмбрионы и животных.

В серодиагностике вирусных инфекций определяют динамику нарастания титра вируснейтрализующих антител по известному вирусу. При этом ставят РН с парными сыворотками, взятыми от больных в начале и в конце болезни. Диагностическим явится 4-кратное возрастание титра иммуноглобулинов во второй из них.

Реакция нейтрализации основана на способности специфических антител достаточно прочно соединяться с вирусной частицей. В результате взаимодействия между вирусом и антителом происходит нейтрализация инфекционной активности вируса вследствие блокады антигенных детерминант, ответственных за соединение вирусной частицы с чувствительными клетками. В результате вирус утрачивает способность размножаться в чувствительной к нему биологической системе in vitro или in vivo.

Результаты РН становятся очевидными после того, как смесь вируса и гомологичных ему антител после определенной по времени экспозиции будет внесена в чувствительную биологическую систему (тканевая культура клеток, куриный эмбрион, организм восприимчивого животного), где вирус может размножаться и вызывать поддающиеся учету изменения, которые будут подавлены частично или полностью в присутствии антител.

В РН участвуют три компонента: а) вирус, б) сыворотка, содержащая антитела, в) биологический объект (лабораторные животные, развивающиеся куриные эмбрионы, тканевые культуры). Выбор компонента зависит от вида вируса, с которым предполагается проводить исследования.

Реакцию нейтрализации используют либо для идентификации выделенного возбудителя, либо для обнаружения и титрования антител в сыворотках.

В первом случае пользуются сыворотками специально иммунизированных лабораторных животных или переболевших людей. Во втором – применяют сыворотки, взятые в начальной стадии болезни и в период реконвалесценции.

Вируснейтрализующие антитела в сыворотках переболевших людей в отличие от антигемагглютининов или комплементсвязывающих антител сохраняются многие годы, а при некоторых вирусных инфекциях (например, при кори) даже пожизненно. Это позволяет в ряде случаев использовать пул сывороток многих реконвалесцентов в качестве референс-препарата, который после разлива в ампулы и лиофилизации пригоден для диагностической работы в течение длительного времени.

При идентификации выделенных возбудителей пользуются заранее приготовленными гипериммунными сыворотками различных животных: кроликов, белых крыс и мышей, морских свинок, обезьян, баранов, лошадей и т. д.

Активность гипериммунных сывороток для РН зависит от способа иммунизации животных.

Перед постановкой каждого нейтрализационного опыта вирус предварительно титруют, определяя конечное разведение, вызывающее повреждение культуры ткани либо инфицирование лабораторных животных (или куриных эмбрионов).

Титр вируса выражают в 50 % дозе (ТКИД₅₀ – 50 % инфекционная доза для тканевой культуры).

Первоначально в историческом плане под инфекцией понимали заражение венерическими заболеваниями. В настоящее время термин инфекционный процесс, инфекция (от лат. inficio – загрязнять, вносить что-либо извне) обозначает эволюционно сложившиеся взаимоотношения восприимчивого человеческого организма (макроорганизма) и болезнетворного, или патогенного, микроорганизма в определенных условиях внешней и социальной среды. Крайней степенью этого взаимодействия является инфекционная болезнь – совокупность обусловленных биологическими агентами расстройств нормального функционирования организма. Клинические проявления инфекционного процесса изучает наука инфектология, а проявление инфекции в человеческих коллективах изучает эпидемиология.

Термин эпидемия происходит от греческих слов эпи — в, на и демос – народ. Целью эпидемиологии является изучение механизма возникновения и развития эпидемического процесса, а также разработка и применение методов предупреждения инфекционных болезней и борьбы с ними.

7.1. Особенности эпидемиологии инфекционных заболеваний

Патология инфекционной природы имеет характерные отличия от других заболеваний:

1. Инфекционные болезни вызываются живыми микроорганизмами, за исключением вирусов и прионов.

2. Инфекционным болезням свойственна контагиозность (заразность).

3. Для инфекционных болезней характерен скрытый (инкубационный) период.

4. После перенесенных инфекционных болезней, как правило, развивается невосприимчивость к повторному заражению тем же возбудителем (иммунитет).

В годы «золотого века» микробиологии (конец XIX – начало XX в.) господствовала так называемая триада Коха, которая подчеркивала ведущую роль микроорганизма в развитии инфекционнoго процесса. Основные постулаты этой триады:

• микроорганизм всегда должен встречаться при конкретной инфекции и не встречаться у здоровых индивидуумов или у больных другими инфекциями;

• микроорганизм должен быть выделен от больного в чистой культуре;

• чистая культура микроорганизма, введенная в организм другого человека (лабораторного животного), должна вызывать то же самое заболевание.

В дальнейшем эмпирические наблюдения привели к полному пересмотру всех положений этой доктрины. Было установлено, что развитие болезни зависит не только от свойств возбудителя, но и от состояния макроорганизма (организма человека), которое, в свою очередь, определяется условиями его существования. Наиболее полно сущность взаимоотношений патогенных микроорганизмов с организмом человека раскрыл В. Д. Беляков в 1986 г., описавший процесс взаимодействия гетерогенных (чужеродных) популяций паразита и хозяина, наступающий при наличии необходимых и достаточных социальных и природных факторов и проявляющийся у зараженных людей развитием манифестных (явных) и бессимптомных форм инфекций.

Инфекция – это сложное биологическое явление, возникающее в результате взаимодействия микроорганизмов с макроорганизмами животного или растительного происхождения. Она отображает общебиологический закон симбиоза, сформировавшегося в процессе эволюции. Все разновидности симбиотических взаимоотношений (комменсализм, мутуализм, паразитизм), наблюдаемые у высокоорганизованных живых существ, присущи также и микроорганизмам. При комменсализме совместное существование нормальной микрофлоры тела человека и самого человеческого организма никому из членов сообщества не наносит ущерба.

При мутуализме из совместного существования оба члена сообщества извлекают пользу. Так, многие представители микрофлоры толстого кишечника синтезируют биологически активные вещества, утилизируя, в свою очередь, питательные субстраты, поступившие в желудочно-кишечный тракт. И только при паразитизме микроорганизм наносит существенный вред своему хозяину – человеческому организму.

Под источником инфекции подразумевают любую естественную среду (резервуар) обитания патогенного микроорганизма. Как правило, это заболевший или инфицированный человек, от которого могут заразиться другие люди. Однако инфекцию нельзя отождествлять исключительно с микроорганизмом – возбудителем заболевания. Большую роль играет восприимчивость человеческого организма. И третьим компонентом в сложном взаимодействии микро- и макроорганизма является механизм передачи возбудителя.

Инфекционные болезни проявляются, как правило, формированием эпидемических очагов (место заражения и нахождения заболевшего человека, окружающие его люди и животные, а также сама территория, в пределах которой возможно заражение).

Под эпидемическим процессом следует понимать возникновение и распространение инфекционных заболеваний. Это непрерывная цепь последовательно возникающих однородных заболеваний. Данный процесс проявляется в форме эпидемической и экзотической заболеваемости.

Эпидемическая заболеваемость постоянно наблюдается в конкретной местности, а экзотическая отмечается при завозе инфекций в те районы, где ранее эта инфекция не отмечалась. Для характеристики интенсивности эпидемиологического процесса используются такие понятия как спорадическая заболеваемость, эпидемическая вспышка, эпидемия и пандемия.

Спорадическая заболеваемость – это обычная характерная для данной местности и времени года заболеваемость, характеризующаяся появлением отдельных разрозненных случаев инфекции. Под эпидемической вспышкой следует понимать ограниченный во времени и по территории резкий подъем заболеваемости, связанный с одномоментным заражением. Эпидемия — это более широкое распространение инфекции, значительно превышающее обычно регистрируемый в данной местности уровень заболеваемости. Пандемия – огромное как по уровню, так и по масштабам распространение инфекции, с охватом ряда стран, континентов и даже всего земного шара. Под терминами эпизоотия (панзоотия) следует подразумевать эпидемию (пандемию) у животных.

Выделяют следующие классы инфекций, исходя из их источника: антропонозы (передаются от человека); зоонозы (передаются от животных); сапронозы (возбудители локализованы во внешней среде). Под механизмом передачи следует подразумевать эволюционно сложившийся способ переноса патогенных микроорганизмов от источника инфекции в восприимчивый человеческий организм. Он состоит из трех фаз:

– выведения микроорганизма из зараженного макроорганизма;

– пребывания микроорганизма во внешней среде;

– внедрения в другой организм.

При этом механизм передачи возбудителя может быть реализован тремя путями: фекально-оральным (энтеральным); воздушнокапельным (аэрозольным); контактно-бытовым (трансмиссивным).

Входные ворота инфекции – это ткани, лишенные физиологической защиты против конкретного возбудителя той или иной инфекции. К ним относятся слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта при энтеральных инфекциях, слизистые оболочки трахеи и бронхов при аэрозольных инфекциях, кожа и слизистые оболочки при контактно-бытовых инфекциях.

Под восприимчивостью человека к инфекции следует понимать биологические свойства тканей организма человека являться как бы питательной средой для размножения микроорганизмов и отвечать на их внедрение развитием инфекции. Степень восприимчивости зависит от индивидуальной реактивности человека.

Активность эпидемического процесса меняется под влиянием природных и социальных условий. К природным условиям относят климат, ландшафт, окружающий человека, животный и растительный мир, наличие очагов инфекционных заболеваний, стихийные бедствия.

Более значимо влияние социальных условий. Это все многообразие условий жизни: плотность населения, жилищные условия, санитарно-коммунальное благоустройство населенных пунктов, материальное благосостояние, условия труда, культурный уровень человека, миграция населения и, наконец, состояние здравоохранения.

7.2. Общая характеристика инфекционного процесса

Любое инфекционное заболевание характеризуется цикличностью течения.

1. Инкубационный период начинается с момента внедрения микроорганизма в макроорганизм до появления первых клинических симптомов болезни. Длительность данного периода составляет от буквально часов до нескольких недель. В это время происходит адгезия микроорганизма на слизистых оболочках небных миндалин, дыхательных путей, желудочно-кишечного и мочеполового трактов. При этом микроорганизм, как правило, не выделяется во внешнюю среду, т. е. больной пока не представляет опасности для окружающих. 2. В продромальном периоде, который длится обычно 1 – 2 суток, регистрируются такие неспецифические признаки болезни, как общая слабость, головная боль, повышение температуры тела. Однако типичные для каждого конкретного инфекционного заболевания (патогномонические) симптомы не выявляются. В это время происходит колонизация чувствительных клеток макроорганизма. Возбудитель болезни уже может выделяться во внешнюю среду.

3. В период разгара болезни появляются патогномонические симптомы, характерные для данной конкретной болезни. В это время имеет место интенсивное размножение возбудителя в организме, накопление больших количеств токсинов и ферментов, поступающих в кровь. Возбудитель активно выделяется из организма больного во внешнюю среду.

4. Период реконвалесценции (выздоровления) характеризуется нормализацией функций организма с прекращением размножения и гибелью (последнее происходит необязательно) возбудителя.

Иногда возбудитель сохраняется в организме, несмотря на клиническое выздоровление. Такое состояние называется микробоносительством. Микробоносительство нельзя путать с персистенцией – длительным «переживанием» микроорганизмов-возбудителей той или иной инфекции в организме человека. В отличие от микробоносительства в состоянии персистенции возбудитель не выделяется во внешнюю среду. Реинфекция – это заболевание, возникшее после выздоровления вследствие повторного заражения тем же самым возбудителем. При суперинфекции, в отличие от реинфекции, заражение происходит в организме до выздоровления. Под рецидивом следует понимать возврат клинических симптомов болезни без повторного заражения за счет оставшихся в организме возбудителей.

Если инфекция протекает без выраженных симптомов, то это – бессимптомная инфекция. В случае яркой выраженности клинических симптомов инфекция называется манифестной. При резком снижении защитных сил макроорганизма (иммунодефицитном состоянии) может развиться эндогенная инфекция, вызываемая представителями нормальной микрофлоры тела человека. В то же время экзогенная инфекция детерминирована проникновением микроорганизмов в организм человека извне. Различают также моноинфекцию, вызываемую одним возбудителем, и микстинфекцию, обусловленную несколькими возбудителями.

7.3. Патогенные свойства микроорганизмов

Характеризуя микроорганизм-возбудитель той или иной инфекции, следует остановиться на таком понятии, как патогенность – потенциальная способность определенных видов микроорганизмов вызывать инфекционный процесс. Это – видовой признак. Степень (мера) патогенности конкретного штамма возбудителя — вирулентность. Факторы патогенности (вирулентности) микроорганизмов подразделяют на три группы:

• определяющие взаимодействие возбудителей со слизистыми оболочками пораженных органов;

• придающие возбудителям устойчивость к механизмам защиты человеческого организма и обеспечивающие способность в нем размножаться;

• способные продуцировать токсины (яды), участвующие в развитии инфекционного процесса.

К факторам патогенности бактерий относятся адгезины, наличие капсулы, способность размножаться на слизистых оболочках (колонизация), способность проникать в клетки (пенетрация) или в подлежащие ткани (инвазия), способность противостоять механизмам защиты хозяина (агрессия). Их можно рассматривать как различные функциональные проявления вирулентных свойств, характеризующих патогенные микроорганизмы.

Адгезины – это микробные белки поверхностей бактериальной клетки, отвечающие за прилипание (прикрепление) к эпителию слизистых оболочек. Взаимодействие микробов и клеток организма очень специфично. Одни микроорганизмы колонизируют эпителий желудочно-кишечного тракта, прикрепляясь к нему, другие – дыхательных путей и т. д. Механизм взаимодействия микро- и макроорганизма реализуется при участии электростатических сил, гидрофобных свойств поверхностей и посредством функционирования рецепторного аппарата.

Капсула бактерий подавляет начальные этапы защитных реакций – распознавание и поглощение, экранируя бактерии.

Под пенетрацией следует понимать способность некоторых возбудителей проникать внутрь эпителиальных клеток, лимфоцитов или лейкоцитов. При этом клетки разрушаются, что сопровождается нарушением целостности эпителиального покрова соответствующего органа. Инвазия – способность возбудителей проникать через слизистые и соединительнотканные барьеры в подлежащие ткани. Эта способность связана с продуцированием таких ферментов, как гиалуронатлиаза и нейраминидаза. Гиалуронидаза специфически расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав межклеточного вещества, тем самым повышая проницаемость слизистых оболочек. Нейраминидаза облегчает преодоление слоя слизи, проникновение внутрь клеток и распространение в межклеточных пространствах.

Агрессия – это способность возбудителя подавлять неспецифическую и иммунную защиту организма хозяина. Сюда же можно отнести наличие капсулы и различные белковые структуры бактериальной клетки, липополисахариды грамотрицательных бактерий. Защитные свойства макроорганизма подавляются также ферментами, продуцируемыми возбудителями. К ним относятся протеазы (разрушают антитела), коагулазы (свертывают плазму крови), фибринолизин (растворяет сгустки фибрина), лецитиназа (расщепляет лецитин) и т. д.

Токсины, или яды бактерий, традиционно подразделяют на экзои эндотоксины. Экзотоксины – это продукты метаболизма, как правило, грамположительных бактерий. Они имеют белковую природу, поэтому высокоиммуногенны и не так тесно связаны с бактериальной клеткой, как эндотоксины. Действие экзотоксинов на макроорганизм высокоспецифично. Так, цитотоксины блокируют биосинтез белка на субклеточном уровне, мембранотоксины повышают проницаемость мембраны эритроцитов (гемолизины) и лейкоцитов (лейкоцидины). Функциональные блокаторы включают энтеротоксины, нейротоксины и токсикоблокаторы. Эксфолиатины и эритрогенины влияют на процессы взаимодействия клеток между собой и с межклеточным веществом.

К эндотоксинам относят метаболиты, как правило, грамотрицательных бактерий, они тесно связаны с бактериальной клеткой и высвобождаются только после гибели клеток. По химической природе это липополисахариды (ЛПС). Эндотоксины являются слабыми иммуногенами. Действие токсинов на макроорганизм малоспецифично и, как правило, однотипно – интоксикация, слабость, падение артериального давления.

Токсичность (так же, как и вирулентность) может быть оценена количественно. К единицам измерения вирулентности (токсичности) относят DLM (dosis letalis minima) – минимальное количество микроорганизмов или токсинов, вызывающее гибель большинства (80 %) лабораторных животных, DCL (dosis certa letalis) – гибель абсолютно всех животных и LD₅₀ – гибель 50 % подопытных животных.

Отдельно рассматривается инфицирующая доза (ID) – минимальное количество микроорганизмов или токсина, способное при попадании внутрь организма вызвать заболевание. Так, например, для туляремии величина ID составляет 1–2 КОЕ, для шигеллезов – 10² КОЕ, для брюшного тифа – 10⁵ КОЕ, а для холеры – 10¹⁰ КОЕ.

Факторы патогенности микроорганизмов контролируются хромосомными и плазмидными генами. Контроль токсинообразования осуществляют также конвертирующие бактериофаги. Изменчивость вирулентности может носить гено- или фенотипирующий характер. Генотипическое снижение вирулентности имеет место при мутациях, рекомбинациях, утере внехромосомных наследственных факторов (плазмид, IS-последовательностей, транспозонов). Фенотипическое ее снижение возможно при попадании возбудителя в неблагоприятные условия, такие как неоптимальный режим культивирования, обработка микроорганизма гомологичной сывороткой. Снижение вирулентности может быть также обусловлено не потерей вирулентных свойств, а селекцией маловирулентных устойчивых штаммов в гетерогенной популяции возбудителя.

7.4. Микроэкология ротовой полости и желудочно-кишечного тракта

Микроэкология изучает взаимоотношения микро- и макроорганизмов в определенной среде обитания. Под термином микрофлора (микробиота) следует понимать эволюционно сложившийся открытый биоценоз микроорганизмов, заселяющих поверхности и полости тела человека. Человек имеет достаточно обильную микробную флору на внешних покровах тела и в полостях, сообщающихся с внешней средой. Большая часть микробов концентрируется в желудочно-кишечном тракте, особенно в толстом кишечнике.

Полость рта со слюной, имеющей щелочную реакцию, с пищевыми остатками и с ее «термостатной» температурой является естественным резервуаром для развития микроорганизмов. В ротовой полости обнаружено до 200 видов микроорганизмов, их концентрация в слюне составляет около 5 млрд КОЕ/мл, в зубном налете – их в тысячу раз больше.

В подъязычной области, в складках слизистой в полости рта постоянно встречаются следующие виды:

• Streptococcus mutans, S. mitis, S. salivarium, S. sanguis;

• представители родов Peptococcus, Veilonella.

На нёбных миндалинах в норме можно обнаружить стрептококков, коринебактерий, нейссерий, псевдомонад, гемофилов, нокардий и дрожжевых грибов. В слюне преобладают извитые микроорганизмы – трепонемы и спириллы, в десневом желобе – анаэробы (бактероиды, фузобактерии, лептотрихии, кампилобактеры, спирохеты и т. д.). Вырабатывая органические кислоты при разложении углеводных остатков пищи, бактерии полости рта способствуют разрушению эмали зубов и развитию кариеса. Поэтому систематический уход за полостью рта с механическим удалением пищевых остатков и микробной массы является важным мероприятием личной гигиены.

Желудочно-кишечный тракт – сбалансированная биологическая система, внутри которой существуют многочисленные связи между микроорганизмами, образующие стабильные сообщества. Микрофлора желудочно-кишечного тракта в разных его отделах имеет свои особенности. В глотке и пищеводе микроорганизмы отсутствуют. Кислая среда желудка также неблагоприятна для размножения микроорганизмов. Нормальный желудок является местом массовой гибели попадающих в него микроорганизмов, поэтому микрофлора желудка обычно очень бедна: там могут существовать только некоторые виды кислотоустойчивых бактерий и вирусов (дрожжи и лактобактерии, энтеровирусы). Однако при заболеваниях, сопровождающихся пониженной кислотностью, в желудке развивается богатая микрофлора, включающая сарцин, бацилл (B. subtilis), дрожжи и некоторые другие микроорганизмы. Неоднозначно оценивается и роль столь «модного» ныне микроорганизма — Heicobacter pylori.

Начиная с двенадцатиперстной кишки, где содержимое ощелачивается секретом поджелудочной железы и желчью, среда более благоприятна для жизнедеятельности бактерий. Анатомически кишечник разделен баугиниевой заслонкой на две экологических ниши – тонкий и толстый кишечник. Тонкий кишечник в норме содержит лишь скудную и непостоянную микрофлору. Зато в толстой кишке содержится обильнейшая микрофлора. Взрослый человек ежедневно выделяет с экскрементами в среднем около 10¹² бактерий, составляющих до половины сухой массы фекалий.

Кишечный тракт новорожденных в первые часы жизни стерилен, но уже через 10 – 12 ч он населяется микроорганизмами, при этом кишечная микрофлора в первые 2 – 3 дня жизни носит еще случайный характер. В дальнейшем господствующее положение приобретает грамположительная анаэробная молочнокислая флора, которая вырабатывает (при расщеплении лактозы) молочную кислоту, подавляя тем самым развитие любой иной, особенно гнилостной, флоры в кишечнике ребенка. Бифидобактерии являются, по-видимому, весьма полезным фактором, защищающим малоустойчивый организм грудного младенца от кишечных расстройств. Наряду с бифидобактериями в относительно небольшом количестве развивается и другая молочнокислая микрофлора. Это так называемая «bifidum-флора» фекалий младенца, чрезвычайно характерная для кишечного содержимого грудных детей, она обычно удерживается до 1 года, когда начинается прикармливание ребенка и прекращается вскармливание материнской грудью.

В течение дальнейшей жизни микробный пейзаж кишечника постепенно сменяется микрофлорой взрослых. В кишечнике взрослого человека насчитывается около 500 видов микроорганизмов. Преобладающей микрофлорой являются облигатные анаэробы, которые превышают количество факультативных анаэробов и аэробов в 100 – 1000 раз. В таком составе с ббльшими или меньшими сдвигами, в зависимости от климато-географического региона, сезонности, режима питания, кишечная флора удерживается до самой смерти (табл. 7).

Микрофлора кишечника обеспечивает газовый состав и кинетическую регуляцию его деятельности, водно-солевой обмен, продуцирует биологически активные соединения, обладает детоксицирующей активностью, обеспечивает продукцию витаминов. Нормальная микрофлора кишечника защищает его от колонизации патогенными и условно-патогенными бактериями, обеспечивая колонизационную резистентность.

Таблица 7

Нормальные показатели микрофлоры желудочно-кишечного тракта

Кишечная стенка в нормальном состоянии практически непроницаема для микроорганизмов. Нарушение ее целостности приводит к вторжению бактерий из кишечника в стерильные внутренние ткани и полости тела (транслокация), в результате чего развиваются тяжелые заболевания часто с летальным исходом.

При нарушении количественного состава микрофлоры толстого кишечника в организме человека развиваются функциональные нарушения, под названием «дисбактериоз, или дисбиоз, кишечника». Согласно Приказа МЗ РФ от 9 июня 2003 г. № 231, следует говорить именно о дисбактериозе кишечника. Различают четыре последовательные стадии дисбактериоза:

1) уменьшение количества лактобактерий;

2) уменьшение количества бифидобактерий;

3) преобладание гемолитических форм бактерий и дрожжевых грибов;

4) преобладание гемолитических форм бактерий и дрожжевых грибов с повышенным содержанием бактерий рода Proteus.

Для коррекции дисбиоза кишечника широко используются бактерии-антагонисты. Еще великий И. И. Мечников предложил для борьбы со старением принимать внутрь простоквашу на основе Lactobacillus bulgaricus.

Ныне это очень перспективное направление в лечении дисбактериоза. Лекарственные препараты на основе живых бактерийантагонистов, предназначенные для коррекции нормальной микрофлоры, называют эубиотиками. Более широкий термин пробиотики был предложен Д. Лилли и Р. Стилвеллом в 1965 г. Это живые микроорганизмы и вещества микробного и иного происхождения, оказывающие при естественном способе введения благоприятное влияние на физиологические функции макроорганизма через оптимизацию его микроэкологического статуса. Различают также и пребиотики – химические соединения, в основном природного происхождения, включение которых в пищевой рацион способствует накоплению определенных групп микроорганизмов.

К пребиотикам относят эубикор, лактулозу, ксилобиозу, соевый олигосахарид и другие вещества, предназначенные для стимуляции роста лакто- и бифидофлоры.

Пробиотики получают на основе либо бифидобактерий (бифидумбактерин, бификол), либо лактобактерий (лактобактерин, ацилакт, аципол), либо споровых бактерий (биоспорин, бактисубтил), реже на основе условно-патогенных кишечных палочек (биофлор).

Широкое распространение получили в последнее время так называемые симбиотики — препараты, сочетающие несколько пробиотиков, например линекс – препарат на основе L. acidophilus, B. infantis, S. faecium. Если препараты содержат пробиотики в сочетании с пребиотиками, то такие препараты называют синбиотиками (бифиформ, ламинолакт).

В настоящее время все эти продукты, согласно ГОСТ Р 52349-05, можно отнести к функциональным пищевым продуктам, которые занимают место между лекарствами и обычными пищевыми продуктами.

7.5. Микроэкология кожи, глаз и дыхательных путей

Различают собственную и транзиторную микрофлору кожи. Под влиянием бактерицидных факторов пота, секрета сальных желез кожа имеет кислую среду. В этих условиях на коже выживают только эпидермальные стафилококки, микрококки, сарцины и непатогенные коринебактерии. Возможно транзиторное нахождение на поверхности кожи золотистых стафилококков и различных видов стрептококков.

Основные зоны колонизации – верхние отделы волосяных фолликулов, кожные железы, эпидермис и роговой слой кожи.

Микрофлора волосяного покрова идентична микрофлоре кожи. На1см² приходится 10³– 10⁴ микроорганизмов, а на участках с повышенной влажностью (кожные складки) – 10⁶.

Верхние отделы респираторного тракта физиологически наиболее приспособлены для осаждения микроорганизмов из выдыхаемого воздуха. Здесь осаждается 75 % всех микроорганизмов. Преобладают различные стрептококки, нейссерии, стафилококки, энтеробактерии.

В носоглотке можно обнаружить менингококков, стрептококков и пневмококков, встречаются и бордетеллы. Это так называемое резидентное носительство.

Трахея и бронхи стерильны, так как воздух очищается от бактерий в верхних отделах респираторного тракта. Проскочившие микроорганизмы удаляются с помощью ворсинок эпителия или уничтожаются макрофагами. При нарушении активности эпителия бронхов (наркоз) микроорганизмы проникают в глубь бронхиального дерева. Мелкие бронхи, альвеолы и паренхима легких стерильны.

Слезная жидкость обладает бактерицидным действием, поэтому большая часть микроорганизмов, попавших на слизистую оболочку глаз, гибнет. При снижении бактерицидной активности слезной жидкости возникают инфекционно-воспалительные процессы. Чаще всего эти процессы вызываются золотистыми стафилококками, коринебактериями и пневмококками.

7.6. Микроэкология мочеполовой системы

Верхние отделы мочевыводящих путей (почки, мочеточники) в норме стерильны. В нижних отделах могут встречаться негемолитические стрептококки, непатогенные коринебактерии, стафилококки, микобактерии (M. smegmatis) и кандиды. В 1 мл мочи должно обнаруживаться не более 10⁴ КОЕ.

Микроэкосистема женских половых органов является динамичной системой, зависящей от гормонального статуса. Особенностью этой системы является метаболическое взаимоотношение эпителия, влагалищной жидкости и микроорганизмов.

Под влиянием женских половых гормонов-эстрогенов цилиндрический эпителий вагины насыщается гликогеном, который утилизируется палочками Додерляйна (Lactobacillus acidophilus). В результате образования молочной кислоты рН среды смещается в кислую сторону, что препятствует колонизации влагалища другими микроорганизмами. Довольно редко во влагалище могут встречаться бифидобактерии, кокки и непатогенные коринебактерии.

В цервикальном канале помимо вышеназванных микроорганизмов встречаются пептострептококки, а при беременности могут появиться кандиды. Матка в норме всегда стерильна.

У девочек первых месяцев жизни характер микрофлоры такой же как и у взрослых женщин, что объясняется действием материнских эстрогенов. Когда действие этих гормонов прекращается, лактобациллы исчезают и реакция среды становится слабощелочной. Появляется кокковая микрофлора, которая обладает слабым антагонистическим действием, поэтому девочки так подвержены риску заражения венерическими инфекциями через контаминированные предметы личной гигиены.

8.1. Антибактериальные препараты

Крупнейшим достижением медицины XX в. является открытие антимикробных лекарственных препаратов, используемых для подавления жизнедеятельности возбудителей в человеческом организме. Эти лекарственные препараты должны вызывать гибель или задерживать размножение патогенных микроорганизмов, но при этом не нарушать функции жизненно важных систем организма человека.

Эмпирическое применение химических веществ для лечения заразных болезней известно человечеству с доисторической эпохи. Так, аборигены Бразилии лечили «кровавые поносы» корнем ипекакуаны. Убежденный сторонник химического метода лечения заразных болезней выдающийся швейцарский химик и врач Филипп Ауреол Теофраст Бомбаст фон Гогенгейм, называвший себя Парацельсом, предлагал в качестве лечебных средств ртуть, железо, серу и свинец. Под влиянием его идей во Франции в XVI в. был издан закон об обязательном лечении сифилиса ртутью. В XVII в. в Европу проник метод лечения малярии с помощью коры хинного дерева, издавна применявшийся индейцами в Южной Америке.

Большое значение в разработке методов профилактики и лечения инфекционных заболеваний имело открытие явления микробного антагонизма. Антагонистические отношения между микроорганизмами различных видов впервые описал Луи Пастер в 1877 г. Он установил, что гнилостные бактерии быстро убивают возбудителей сибирской язвы в смешанных культурах. С присущей ему прозорливостью Л. Пастер указал, что явление микробного антагонизма в будущем будет широко использоваться медициной.

В 1871 – 1872 гг. сотрудники Медико-хирургической академии В. А. Манассеин и А. Г. Полотебнов впервые использовали экстракты из культур плесневого гриба Penicillium glaucum для лечения гнойных ран. Однако основы современного учения об антагонизме микробов и практического использования этого явления в медицине были заложены И. И. Мечниковым. Под его руководством были выявлены две формы микробного антагонизма (активная и пассивная) и установлено, что антагонизм – это такая форма межвидовых отношений, при которой совместное обитание двух популяций микроорганизмов приводит к значительному угнетению роста и размножения одной из них вплоть до полного уничтожения. При пассивном антагонизме имеет место конкуренция между микроорганизмами за кислород или окружающие их питательные вещества, а активный антагонизм обусловлен выделением в окружающую среду продуктов микробного метаболизма (кислот, спиртов, антибиотических веществ).

Родоначальником научно обоснованного метода химиотерапии был выдающийся немецкий исследователь Пауль Эрлих, разработавший в 1885 г. «рецепторную теорию». Он предположил, что клетки макро- и микроорганизма имеют специфический рецепторный аппарат и поэтому избирательно взаимодействуют с различными химическими веществами. В основе предложенного П. Эрлихом нового подхода к лечению инфекционных болезней лежало представление о «магической пуле», которая убивает патогенный микроорганизм, но не приносит вреда организму больного. Использующийся для лечения инфекции химиопрепарат должен избирательно поражать микробную клетку-мишень, блокировать метаболизм возбудителя, не затрагивая жизненно важных функций макроорганизма. В 1907 г. после долгих поисков П. Эрлих получил препарат на основе соединений мышьяка (сальварсан) и с успехом использовал его при лечении сифилиса.

Новая эра в развитии антимикробной терапии началась в 1935 г. после открытия немецким ученым Герхардом Домагком синтетических производных сульфаниловой кислоты (сульфаниламидных препаратов). Разработанный им «красный стрептоцид» давал хороший терапевтический эффект при лечении стрептококковой, гонококковой и менингококковой инфекции. Несколько позже группа химиков из парижского Пастеровского института разработала «белый стрептоцид», обладающий более выраженной антимикробной активностью.

Первый антибиотик пенициллин был открыт английским микробиологом сэром Александром Флемингом в 1929 г. Работая с культурами стафилококков, ученый установил, что эти микроорганизмы на плотной питательной среде образуют зоны задержки роста вокруг колоний плесневого гриба Penicillium notatum. Фильтрат P. notatum задерживал рост различных бактерий и не вызывал гибель лабораторных животных.

К сожалению, А. Флеминг так и не смог очистить содержащий антибактериальную субстанцию фильтрат от примесей. Выделить пенициллин в кристаллическом виде и впервые испытать его на больных удалось только в 1940 г. английским исследователям Говарду Флори и Эрнесту Чейну.

В нашей стране пенициллин был получен З. В. Ермольевой в 1942 г. С этого момента в науке возникло и стало успешно развиваться новое направление – учение об антибиотиках.

Термин «антибиотик» (в переводе с греческого «анти» – против, «биос» – жизнь) впервые был предложен в 1942 г. американским микробиологом С. А. Ваксманом для обозначения веществ, образуемых микроорганизмами и обладающих антимикробным действием. Таким образом, антибиотики – это вещества микробного происхождения, а также их полусинтетические и синтетические аналоги, способные избирательно подавлять рост и размножение патогенных микроорганизмов в организме больного. Антибиотики получают путем биосинтеза микробами-продуцентами и изменяя химическим путем молекулы природных антибиотиков. На сегодняшний день известно несколько тысяч антибиотиков, но в практике используется около 200 препаратов. Это связано с тем, что некоторые антимикробные препараты обладают выраженными побочными эффектами («нежелательными реакциями»), что ограничивает широту их применения.

Антибиотики характеризуются избирательностью действия в отношении микроорганизмов и в терапевтических концентрациях не оказывают ядовитого действия на клетки макроорганизма. Избирательность действия связана с угнетением метаболизма в микробной клетке, но не в клетках человека. Это достигается путем связывания антибиотика с определенной мишенью (ферменты и структурные молекулы микроорганизма), что приводит к нарушению функции микробной стенки или цитоплазматической мембраны, торможению синтеза белков или нуклеиновых кислот микроорганизма (табл. 8).

Антибиотики подавляют рост и размножение определенных возбудителей in vitro или в организме больного. Это тесно связано с понятием спектра действия, в соответствии с которым антибиотик эффективен в отношении тех или иных микроорганизмов, но не действует на другие. Так, имеются антибиотики, обладающие активностью в отношении преимущественно грамотрицательных или преимущественно грамположительных бактерий, а также грибов, простейших и т. д. Спектр антимикробной активности антибиотиков связан с особенностями химического строения препаратов.

Широко известно разделение химиопрепаратов на антибиотики широкого и узкого спектра действия. Первые обладают активностью в отношении многих, а вторые – в отношении небольшого числа микроорганизмов. Так, например, тетрациклины и цефалоспорины относятся к антибиотикам широкого спектра действия, а полимиксины (действуют только на грамотрицательные бактерии) – к антибиотикам узкого спектра. Однако в последнее время эта классификация подвергается обоснованной критике, и в первую очередь, из-за отсутствия четких критериев. Спорным является и представление, что антибиотики широкого спектра действия более эффективны при лечении тяжелых инфекций. Таблица 8

таблица8

Классификация антибиотиков по механизму действия

При наличии у больного тяжелых инфекционных осложнений надо ориентироваться не столько на широту антимикробного спектра применяемого для лечения химиопрепарата, сколько на полученные в бактериологической лаборатории результаты определения чувствительности возбудителя заболевания к этому антибиотику.

В отличие от других лекарственных препаратов активность антибиотиков не является постоянной и со временем снижается, что связано с формированием у возбудителей приобретенной устойчивости (резистентности). Антибиотикорезистентные штаммы возбудителей представляют опасность не только для того больного, от которого они выделены, но и для прочих пациентов в данном лечебном учреждении.

Антибиотики обладают бактериостатическим (нарушающим рост и размножение микроорганизмов) или бактерицидным (вызывающим непосредственную гибель микробной клетки) действием. К бактерицидным антибиотикам относятся пенициллины и другие β-лактамные препараты, аминогликозиды, хинолоны и фторхинолоны, полимиксины, гликопептиды, нитроимидазолы, рифамицины, фосфомицин, диоксидин, ко-тримоксазол. Они дают более радикальный эффект и поэтому предпочтительны для лечения тяжелых инфекций (остеомиелита, перитонита, сепсиса и др.). Бактериостатические антибиотики представлены тетрациклинами, амфениколами, макролидами, линкозамидами, сульфаниламидами и нитрофуранами. Их применяют для лечения легких или среднетяжелых форм инфекционных заболеваний (так называемых «малых» инфекций).

Такое разделение антимикробных средств достаточно условно, поскольку бактерицидные препараты в низких концентрациях оказывают бактериостатическое действие, а высокие концентрации бактериостатических антибиотиков в патологическом очаге или in vitro могут вызывать бактерицидный эффект. С другой стороны, в зависимости от возбудителя заболевания один и тот же химиопрепарат может обладать различными типами действия. Так, например, хлорамфеникол является бактерицидным антибиотиком в отношении гемофилов и пневмококков и бактериостатическим – в отношении энтеробактерий.

8.2. Сульфаниламидные препараты

В настоящее время известно около 150 сульфаниламидных препаратов (САП), однако большинство из них вследствие выраженных побочных эффектов и относительно невысокой активности в отношении значительной части патогенных микроорганизмов не находят широкого применения в клинике. Спектр антимикробного действия САП включает шигеллы, хламидии, сальмонеллы и стрептококки.

Механизм антимикробной активности сульфаниламидов связан с нарушением синтеза в микробной клетке важнейших факторов роста (фолиевая кислота и ее производные), в молекулу которых входит парааминобензойная кислота (ПАБК). Химическая структура ПАБК имеет сходство с сульфаниламидными препаратами, которые после поглощения их микроорганизмами («метаболический» обман) блокируют метаболические реакции возбудителей и оказывают таким образом бактериостатическое действие.

К недостаткам сульфаниламидов следует отнести сравнительно высокую токсичность, быстрое возникновение лекарственной устойчивости, которая носит перекрестный характер с другими представителями этой группы, а также широкое распространение сульфаниламидрезистентных возбудителей. САП практически не действуют на стафило- и энтерококки, пиогенные стрептококки, гоно- и менингококки, гемофилы, псевдомонады, энтеробактерии и большинство облигатных анаэробов. Механизм приобретенной устойчивости возбудителей к САП чаще всего детерминирован плазмидами и обусловлен снижением проницаемости клеточной стенки, формированием метаболического шунта и некоторыми другими факторами.

В зависимости от особенностей применения и фармакокинетики (изучает закономерность прохождения и превращения лекарственных препаратов в организме больного) препаратов выделяют следующие группы сульфаниламидов:

1. САП системного действия (сульфадимезин, норсульфазол, этазол, уросульфан, сульфадиметоксин, сульфален и др.) хорошо всасываются из желудочно-кишечного тракта, поэтому их назначают для лечения системных инфекций.

2. Плохо растворимые в воде и медленно всасывающиеся из желудочно-кишечного тракта САП (фталазол, фтазин, сульгин и др.), назначают только внутрь для лечения бактериальных кишечных инфекций.

3. САП для местного применения (сульфадиазин серебра, сульфатиазол серебра, мафенид) нашли применение в лечении ожогов, пролежней, хронических язв. В очаге воспаления входящие в состав препарата ионы серебра диссоциируют и оказывают на микроорганизмы бактерицидное действие. Сульфацил-натрий (альбуцид) используют в офтальмологии при лечении инфекционно-воспалительных заболеваний глаз.

4. Салазосульфаниламиды (салазодин, салазосульфапиридин, салазодиметоксин) предназначены для лечения неспецифического язвенного колита.

8.3. β-Лактамные антибиотики

К β-лактамным антибиотикам (БЛА) относится большая группа антимикробных препаратов (пенициллинов, «комбинированных» препаратов, цефалоспоринов, монобактамов и карбапенемов), объединенных общим механизмом действия и наличием в их химической структуре β-лактамного кольца. Антибактериальный эффект этих лекарственных средств связан с подавлением синтеза пептидогликана клеточной стенки бактерий.

В отличие от аминогликозидных антибиотиков БЛА проявляют оптимальное бактерицидное действие при создании в очаге инфекции концентрации, в 2 – 4 раза превышающей их минимальную подавляющую концентрацию (МПК).

К недостаткам БЛА относится отсутствие клинической эффективности в отношении факультативных или облигатных внутриклеточных микроорганизмов (риккетсии, хламидии, бруцеллы и др.). Это связано с их ограниченной способностью проникать внутрь фагоцитирующих клеток, в которых локализуется возбудитель инфекции. Однако истинной природной резистентностью к β-лактамам обладают только микоплазмы и уреаплазмы ввиду отсутствия у них пептидогликана, который является мишенью для этих антибиотиков.

К группе пенициллинов относятся антибиотики природного происхождения и их биологически активные аналоги, полученные в результате химических превращений природных пенициллинов.

Природные пенициллины (бензилпенициллин, феноксиметилпенициллин и др.) в настоящее время достаточно широко используются в клинике, являясь препаратами выбора при инфекциях, вызванных стрептококками, менингококками, гонококками, облигатными анаэробами и пенициллиназоотрицательными стафилококками. Пролонгированные препараты пенициллина (бензатинпенициллин или бициллин) назначают для профилактики ревматизма и лечения сифилиса.

К полусинтетическим пенициллинам относятся изоксазолил-, амино-, карбокси- и уреидопенициллины.

Изоксазолилпенициллины (оксациллин, клоксациллин, диклоксациллин) применяют для лечения гнойно-воспалительных заболеваний, вызываемых продуцирующими β-лактамазу стафилококками. Эти препараты, сохраняя основные преимущества бензилпенициллина, приобретают новые свойства, главными из которых являются резистентность к стафилококковым β-лактамазам и кислотоустойчивость.

Аминопенициллины (ампициллин, амоксициллин и др.) относятся к антибиотикам широкого спектра действия, задерживающим рост и размножение менингококков, шигелл, сальмонелл и эшерихий.

По сравнению с аминопенициллинами карбоксипенициллины (карбенициллин, тикарциллин) обладают меньшей активностью в отношении грамположительных бактерий, но более широким спектром действия в отношении энтеробактерий (за исключением клебсиелл, протеев) и псевдомонад.

Спектр действия уреидопенициллинов (азлоциллин, мезлоциллин, пиперациллин) включает грамположительные (стрептококки, энтерококки) и грамотрицательные (эшерихии, протеи, шигеллы, иерсинии) аэробные бактерии, клостридии и неспорообразующие анаэробы.

Характерной особенностью карбокси- и уреидопенициллинов является их активность в отношении синегнойной палочки, поэтому их нередко называют «антисинегнойными пенициллинами». Наиболее эффективным является пиперациллин. Карбокси- и уреидопенициллины чувствительны к действию β-лактамаз большинства грамположительных и грамотрицательных бактерий, поэтому госпитальные штаммы возбудителей часто резистентны к этим препаратам. Для профилактики быстрого развития устойчивости в процессе лечения антисинегнойные пенициллины рекомендуется назначать в комбинации с аминогликозидами или фторхинолонами. К недостаткам уреидопенициллинов относится их слабое антимикробное действие на стафилококки.

В настоящее время антибиотики группы цефалоспоринов чаще всего назначают в лечебных учреждениях для профилактики и лечения инфекционных заболеваний и гнойно-септических инфекций. По своим свойствам они близки к полусинтетическим пенициллинам широкого спектра действия. Вместе с тем они имеют ряд преимуществ благодаря более высокой устойчивости к β-лактамазам, способности проникать во многие ткани организма в терапевтических концентрациях, а также более низкой степени связывания с белками сыворотки крови. В отличие от пенициллинов эти химиопрепараты гораздо реже вызывают аллергические реакции. В зависимости от антимикробной активности, устойчивости к гидролитическому действию β-лактамаз и клинической эффективности цефалоспорины делят на четыре поколения.

Спектр антимикробной активности цефалоспоринов первого поколения (цефалотин, цефазолин и др.) во многом обусловлен устойчивостью к гидролитическому действию стафилококковых β-лактамаз и чувствительностью к ним грамотрицательных бактерий. Эти антибиотики характеризуются высокой активностью в отношении стрептококков, коринебактерий, пенициллиназопродуцирующих стафилококков, кишечной палочки, трепонем и клостридий. По уровню активности в отношении пневмококков они уступают аминопенициллинам и большинству цефалоспоринов II – IV поколений. Чувствительность гонококков и менингококков, шигелл и сальмонелл к этим препаратам in vitro клинического значения практически не имеет.

К недостаткам цефалоспоринов первого поколения относятся отсутствие антимикробной активности против целого ряда грамотрицательных возбудителей (серраций, провиденций, морганелл, цитробактеров, бактероидов), плохое проникновение через гематоэнцефалический и гематоофтальмический барьеры, а также в ткани предстательной железы.

Цефалоспорины второго поколения (цефамандол, цефуроксим и др.) включают подгруппу цефамицинов (цефокситин, цефотетан, цефметазол) и обладают, по сравнению с предыдущей группой, несколько большей активностью в отношении грамотрицательных бактерий (Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Shigella spp., Salmonella spp., Haemophilus spp., Neisseria spp.). Расширение спектра действия обусловлено стабильностью к действию некоторых β-лактамаз и улучшением проникновения через клеточную стенку бактерий.

Наиболее высокой антистафилококковой активностью обладает цефамандол. Характерной особенностью цефамицинов является выраженная активность в отношении неспорообразующих анаэробов (особенно Bacteroides fragilis), превосходящая активность многих цефалоспоринов третьего поколения. В связи со специфичностью спектра действия этих препаратов они особенно показаны при лечении перитонитов.

К пероральным препаратам относятся цефуроксим аксетил и цефаклор. Из многочисленных представителей цефалоспоринов третьего поколения наибольшее распространение в России получили цефотаксим (клафоран), цефтриаксон (роцефин), цефтазидим (фортум), моксалактам и некоторые другие препараты. Эти антибиотики хорошо проникают через гематоэнцефалический барьер. Спектр действия цефалоспоринов III поколения, который включает семейство энтеробактерий, нейссерии, гемофилы, оксациллинчувствительные стафилококки, стрептококки и другие возбудители, во многом определяет устойчивость этих препаратов к некоторым β-лактамазам (плазмидным β-лактамазам стафилококков, β-лактамазам широкого спектра грамотрицательных бактерий, хромосомным β-лактамазам класса А). Основным показанием к их назначению являются тяжелые гнойно-септические осложнения, вызванные полирезистентными грамотрицательными бактериями.

Цефалоспорины третьего поколения обладают различной активностью в отношении псевдомонад. При инфекциях, вызванных синегнойной палочкой, препаратом выбора является цефтазидим (фортум). Несколько меньшей активностью обладает цефоперазон.

Цефтриаксон, цефтазидим, цефоперазон, цефсулодин слабо действуют на неспорообразующие анаэробы. Поэтому при неклостридиальной инфекции необходимо сочетание этих антибиотиков с метронидазолом. Наибольшей активностью в отношении анаэробов среди цефалоспоринов третьего поколения обладает моксалактам. Кроме того, этот препарат высокоэффективен против многих энтеробактерий, поэтому его часто рекомендуют для лечения еще до получения результатов бактериологических исследований при перитонитах, развивающихся после перфорации кишечника, резекции толстой кишки и др. Пенициллинрезистентные стрептококки (пневмококки, зеленящие стрептококки и др.) сохраняют чувствительность к цефалоспоринам III поколения.

Вместе с тем антибиотики этой группы имеют определенные недостатки. Их действие не распространяется на микроорганизмы, продуцирующие плазмидные β-лактамазы расширенного спектра. Кроме того, при длительном применении эти антибиотики угнетают нормальную микрофлору организма и с целью своевременной профилактики вторичной инфекции требуют контроля колонизационной резистентности. По сравнению с цефалоспоринами I – II поколений они оказывают более слабое действие на стафилококки. Эмпирическое назначение цефалоспоринов III поколения без тщательного бактериологического контроля, особенно при монотерапии, может привести к селекции мультирезистентных штаммов бактерий.

Характерными особенностями цефалоспоринов четвертого поколения (цефпиром, цефепим) являются относительная устойчивость к гидролизу хромосомными β-лактамазами класса С и плазмидными β-лактамазами расширенного спектра, а также более выраженная способность проникать через клеточную стенку грамотрицательных бактерий. Эти антибиотики обладают высокой активностью в отношении стрептококков, стафилококков (за исключением оксациллинрезистентных штаммов), энтеробактерий, псевдомонад и других неферментирующих микроорганизмов, умеренно активны в отношении энтерококков.

За последние десятилетия наблюдается отчетливое увеличение количества инфекций, вызываемых продуцирующими β-лактамазы микроорганизмами. Эти микробные ферменты являются главными факторами, определяющими резистентность к антибиотикам большинства бактерий. В связи с этим одним из методов преодоления микробной устойчивости является комбинирование антибиотиков с ингибиторами β-лактамаз (сульбактам, клавулановая кислота, тазобактам), что позволяет преодолевать инактивацию химиопрепаратов ферментами бактерий. Такие комбинированные препараты получили название «защищенных» β-лактамов.

Большое распространение получили «защищенные» аминопенициллины: амоксиклав, который является сочетанием амоксициллина и клавулановой кислоты (аугментин), и уназин, в котором ингибитор β-лактамазы сульбактам потенцирует антибактериальный эффект ампициллина. Не меньшей популярностью в практике антимикробной терапии пользуются «защищенные» карбоксипенициллины (тикарциллин/клавуланат), «защищенные» уреидопенициллины (пиперациллин/тазобактам) и «защищенные» цефалоспорины (цефоперазон/сульбактам). Благодаря устойчивости к действию стафилококковых β-лактамаз, плазмидных β-лактамаз широкого и расширенного спектров, хромосомных β-лактамаз класса А «защищенные» β-лактамы обладают выраженной активностью в отношении многих «проблемных» возбудителей (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter diversus, Proteus spp., Bacteroides fragilis, Neisseria spp. и др.).

Широкое распространение среди госпитальных штаммов возбудителей-продуцентов хромосомных β-лактамаз класса С ограничивает использование ингибиторзащищенных β-лактамов. Наличие в составе препаратов различных ингибиторов β-лактамаз не дает преимуществ в отношении микроорганизмов, устойчивость которых не связана с продукцией разрушающих антибиотики ферментов (пневмо-, энтерококки, псевдомонады и др.).

Показаниями для применения «защищенных» β-лактамов являются вызванные чувствительными к этим антибиотикам микроорганизмами инфекции дыхательных, мочевыводящих путей, смешанные аэробно-анаэробные, гнойно-воспалительные поражения кожи и мягких тканей, а также использование в целях профилактики гнойно–септических осложнений при хирургических вмешательствах.

Из монобактамных антибиотиков наиболее широкое распространение получил азтреонам (азактам). Он относится к синтетическим антибиотикам, обладающим бактерицидной активностью в отношении широкого спектра грамотрицательных аэробных возбудителей (семейство Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., Neisseria spp.). Обладает резистентностью к большинству микробных β-лактамаз. При парентеральном введении азтреонам хорошо проникает в большинство жидкостей и тканей организма (в том числе в спинномозговую жидкость), обеспечивая создание в них лечебных концентраций.

К недостаткам монобактамов следует отнести перекрестную резистентность с аминогликозидами, дефекты в спектре действия против грамположительных кокков, слабую активность в отношении многих анаэробов.

Карбапенемом первого поколения является имипинем. Он характеризуется широким спектром действия, распространяющимся практически на все основные возбудители гнойно-септических инфекций, включая пенициллинрезистентные стафило- и стрептококки. По активности в отношении возбудителей анаэробной инфекции имипенем сравним с метронидазолом и превосходит линкозамиды и цефамицины. В связи с клинической эффективностью в отношении большинства бактериальных патогенов карбапенемы иногда называют антибиотиками «ультраширокого спектра». Имипенем высокоустойчив к действию большинства микробных β-лактамаз.

В последние годы в практику внедрен представитель второго поколения карбапенемов — меропенем, который не разрушается почечными ферментами. В отличие от имипенема он обладает более высокой активностью в отношении грамотрицательных бактерий и несколько меньшей в отношении стафило- и стрептококков.

К недостаткам карбапенемов следует отнести слабую активность в отношении микроорганизмов родов Proteus, Serratia, Haemophilus и устойчивость оксациллинрезистентных стафилококков.

Основными показаниями к применению карбапенемов являются тяжелые госпитальные инфекции различной локализации, вызванные мультирезистентными штаммами возбудителей.

8.4. Аминогликозиды

Аминогликозидные антибиотики на протяжении многих лет широко используются в клинической практике. Они обладают бактерицидным типом действия и по частоте применения в лечебных учреждениях занимают второе место после β-лактамов. В отличие от последних аминогликозиды очень редко вызывают аллергические реакции. Механизм действия препаратов этой группы связан с подавлением синтеза белка путем необратимого связывания с бактериальными рибосомами.

Резистентность микроорганизмов к этим препаратам связана с продукцией бактериями аминогликозидмодифицирующих ферментов (фосфо-, ацетил- и аденилилтрансфераз). Аминогликозидные антибиотики применяют преимущественно при инфекционно-воспалительных процессах, вызванных грамотрицательными бактериями. Бактерицидный эффект усиливается при сочетании этих препаратов с аминопенициллинами (против листерий, стрепто- и энтерококков), прочими β-лактамами и фторхинолонами (против грамотрицательных бактерий), гликопептидами (против стрептои энтерококков), линкозамидами и цефамицинами (против облигатных анаэробов) и котримоксазолом (против нокардий). При энтеральном применении аминогликозиды практически не всасываются и оказывают только местное действие. В связи с этим, а также с учетом антимикробного спектра препараты канамицин и неомицин используют в предоперационном периоде для селективной деконтаминации кишечника (при подготовке больных к операциям на желудочно-кишечном тракте).

Общими недостатками аминогликозидов являются отсутствие антимикробной активности в отношении внутриклеточно расположенных возбудителей, плохое проникновение через гематоэнцефалический барьер (увеличение проницаемости при воспалении мозговых оболочек), а также наличие потенциальных ото- и нефротоксического эффектов.

Аминогликозиды I поколения (стрептомицин, канамицин, неомицин) в настоящее время относительно редко используются в связи с тем, что большинство «проблемных» возбудителей выработало к ним устойчивость. К стрептомицину сохраняют чувствительность Yersinia pestis, Francisella tularensis, Mycobacterium spp. и Brucella spp., поэтому его применяют для лечения опасных инфекций (чумы, туляремии, бруцеллеза) и туберкулеза. Канамицин назначают внутрь при стафилококковых, шигеллезных и коли-энтеритах, а парентерально – при лечении туберкулеза. Неомицин в связи с выраженной токсичностью применяется только местно.

Аминогликозиды II (гентамицин) и III поколений (сизомицин, тобрамицин, амикацин и др.) высоко эффективны в отношении большинства грамотрицательных бактерий и стафилококков. Гентамицин, как правило, назначают при инфекциях, вызванных условно-патогенными энтеробактериями, синегнойной палочкой и другими неферментирующими микроорганизмами. Основным отличием тобрамицина является его более высокая активность в отношении псевдомонад. Амикацин сохраняет активность в отношении большинства гентамицинрезистентных грамотрицательных бактерий и стафилококков. Он реже, чем другие аминогликозиды, дает побочные эффекты, обладает выраженной устойчивостью к аминогликозидмодифицирующим ферментам и хорошими фармакокинетическими свойствами (легко проникает в ткани организма, в центральную нервную систему, слабо связывается с белками сыворотки крови и др.). Устойчивые к амикацину грамотрицательные бактерии, как правило, устойчивы и к другим аминогликозидам.

Сизомицин применяют по тем же показаниям, что и названные выше препараты, однако он превосходит последние по степени антибактериальной активности в отношении ряда грамотрицательных возбудителей (Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus spp., Citrobacter spp.). Гента-, тобра- и сизомицин в клинически значимых концентрациях неактивны в отношении Mycobacterium tuberculosis, а амикацин обладает высокой активностью в отношении атипичных микобактерий.

Основными показаниями для назначения аминогликозидов II – III поколений являются антимикробная профилактика и терапия инфекций, вызванных грамотрицательными возбудителями.

8.5. Тетрациклины

Тетрациклины относятся к антибиотикам широкого спектра действия, однако в последние годы в связи с широким распространением тетрациклиноустойчивых штаммов применение этих препаратов существенно снизилось. Практический интерес представляют лишь полусинтетические тетрациклины — доксициклин (вибрамицин), метациклин (рондомицин) и миноциклин, которые вытеснили остальные антибиотики этой группы. Тетрациклиновые антибиотики обладают активностью в отношении грамположительных (Bacillus anthracis, Clostridium spp.) и грамотрицательных (Brucella spp., Campylobacter spp., Francisella tularensis, Neisseria meningitidis, Shigella spp., Vibrio cholerae, Yersinia spp., Helicobacter pylori) микроорганизмов.

Характерной особенностью препаратов этой группы является эффективность в отношении внутриклеточно расположенных возбудителей (хламидий, микоплазм и риккетсий). Механизм действия данных антибиотиков заключается в ингибиции биосинтеза белка путем связывания с бактериальными рибосомами. Синергетическое действие на микробную клетку наблюдают при сочетании тетрациклинов с макролидами, линкозамидами и рифампицином.

К недостаткам тетрациклинов следует отнести бактериостатический тип действия на микробную клетку и отсутствие антимикробной активности ко многим важным возбудителям. Основной причиной возрастания антибиотикорезистентности бактерий к тетрациклинам является селекция естественно существующих устойчивых вариантов. Чаще всего резистентные к тетрациклинам штаммы обнаруживают среди стафило-, пневмо-, энтерококков, пиогенных стрептококков и грамотрицательных бактерий. Устойчивостью к тетрациклинам обладают многие энтеробактерии, псевдомонады, микобактерии туберкулеза, бактероиды. Резистентность к тетрациклинам чаще всего связана с активным выведением антибиотиков из микробной клетки. Гены, кодирующие систему активного выведения, локализуются на плазмидах.

При аллергии к антибиотикам пенициллиновой группы тетрациклины используют как альтернативные препараты. Наибольшее клиническое применение среди тетрациклинов получил доксициклин. Он обладает активностью в отношении большого числа грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, характеризуется пролонгированным действием и хорошим проникновением в ткани и жидкости организма, однако оказывает только бактериостатический эффект. Самым активным представителем этой группы антибиотиков является миноциклин, но в России он применяется пока редко.

Основными показаниями для назначения тетрациклинов являются опасные инфекции, риккетсиозы, лептоспирозы, хламидиозы, боррелиозы, мико- и уреаплазмозы, сифилис (при аллергии к пенициллинам), хеликобактериозы, глазные и кишечные инфекции.

8.6. Макролиды

В группу макролидных антибиотиков входят природные и полусинтетические препараты, основу химической структуры которых составляет лактонное кольцо. В зависимости от числа атомов углерода в лактонном кольце их делят на 14-членные (эритро-, олеандо-, рокситро-, кларитро-, диритро- и флуритромицин), 15-членные (азитромицин) и 16-членные макролиды.Кмакролидным антибиотикам I поколения («старые» макролиды) относятся эритромицин, олеандомицин и спирамицин, а к препаратам II поколения («новые» макролиды) – кларитромицин, диритромицин, флуритромицин, азитромицин, мидекамицин, джозамицин и рокитамицин. Преимущества препаратов II поколения заключаются прежде всего в большей продолжительности антимикробного действия и лучшей переносимости больными.

Макролиды являются одной из самых безопасных групп антибиотиков, обладают низкими токсичностью и способностью накапливаться в тканях человеческого организма, слабыми аллергизирующими свойствами, противовоспалительным и иммуномодулирующим действием. В высоких концентрациях оказывают бактерицидное действие на некоторые стрептококки. По способности проходить через гистогематические барьеры (за исключением гематоэнцефалического) макролиды превосходят β-лактамные и аминогликозидные антибиотики.

Механизм действия макролидов заключается в подавлении биосинтеза белка в результате связывания антибиотиков с рибосомами. Макролидные антибиотики характеризуются узким спектром действия и эффективны преимущественно в отношении грамположительных и некоторых грамотрицательных аэробных бактерий, а также облигатных анаэробов (клостридий и неспорообразующих анаэробов, за исключением Bacteroides fragilis).

Наиболее ценным качеством макролидов является высокая активность в отношении внутриклеточных микроорганизмов, что связано с хорошим проникновением этих антибиотиков в фагоциты. Макролиды обладают способностью накапливаться в микро- и макрофагах и таким образом попадать в очаг воспаления, где под действием бактериальных и клеточных энзимов происходит выделение антибиотиков в инфицированные ткани.

Синергитический антимикробный эффект наблюдается при комбинации макролидных антибиотиков с тетрациклинами, фторхинолонами и фузидином, антагонистический – при сочетании с линкозамидами и хлорамфениколом.

К недостаткам макролидов относятся бактериостатический тип действия на микробную клетку, отсутствие активности в отношении большинства грамотрицательных бактерий, оксациллинрезистентных стафилококков, энтерококков и нокардий.

Устойчивость к макролидам чаще всего связана со снижением сродства к антибиотикам 50 S субъединицы рибосом. В результате способность макролидов связываться с рибосомами нарушается, а их антибактериальное действие блокируется. Модификацию мишени ускоряют ферменты метилазы. Меньшее клиническое значение имеет резистентность, связанная с нарушением проницаемости микробной стенки, ферментативной инактивацией антибиотиков эстеразами, а также с активным выведением химиопрепаратов из микробной клетки. Отмечается перекрестная резистентность макролидов с линкозамидами.

Эритромицин является основным препаратом среди макролидных антибиотиков, однако он неустойчив в кислой среде желудка. Его нередко назначают для профилактики бактериального эндокардита после стоматологических манипуляций, а совместно с неомицином – для деконтаминации кишечника перед операциями. «Новые» макролиды характеризуются более высокой устойчивостью к низким значениям рН. Олеандомицин в настоящее время применяют очень редко из-за слабой активности и довольно высокой токсичности. Наибольшей активностью против грамотрицательных бактерий обладает азитромицин, который обеспечивает хороший клинический эффект при гонококковой инфекции. Кларитромицин превосходит другие макролиды по действию на стафило- и стрептококки, хламидии и микобактерии.

Конец ознакомительного фрагмента.