Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре. Глава 1 СТАТУС ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ В ЭКОЛОГО-МИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ (Г. В. Ильина, 2013)

1.1 Ксилотрофные базидиомицеты в коллекциях мицелиальных культур

Уникальные свойства грибов, такие их специфические особенности, как значительная питательная ценность, лечебные свойства многих видов, возможности получения ценных веществ и материалов на их основе, интересовали человечество с момента возникновения цивилизации. Другой стороной деятельности грибов, исследование которой представляло и представляет не меньший интерес для человека, является вред, наносимый грибами фито- и зоопатогенами, домовыми грибами и т.п. В связи с этим, изучение грибов началось с глубокой древности. Первое упоминание о грибах имеется уже у Теофраста (III век до н.э.). История культивирования съедобных и лекарственных грибов с целью получения плодовых тел насчитывает тысячи лет (Stamets, 1993; Chang, Miles, 2004; Wasser et al., 2002). Наиболее ярким примером в этом контексте служит трутовик лакированный, традиционно культивируемый в странах Востока.

Бесспорно, одним из крупнейших исследователей является немецкий миколог Антон Де Бари (1831–1888), автор многих фундаментальных работ, основоположник онтогенетического метода в микологии. Именно ему принадлежит первый цикл работ, посвященных вопросам биологии, строения, циклов развития, причин и механизмов старения многих видов грибов. Он работал с чистыми культурами грибов. При этом, в контексте исследований, связанных с чистой культурой, следует упомянуть имя немецкого ученого О. Брефельда (1839–1925), который занимался вопросами филогении грибов и может считаться основоположником метода чистых культур. О. Брефельд обосновал метод стерилизации питательных сред, разработал искусственные питательные среды, на которых проращивал споры головни. Он применил метод односпоровых культур раньше, чем это было сделано в бактериологии (Мирчинк, 1976). Этот момент в развитии науки о грибах Л.И. Курсанов в предисловии к русскому изданию книги Лилли и Барнетта «Физиология грибов» назвал переломным, причем перелом связан с внедрением метода онтогенеза, пришедшего на смену господствовавшего ранее описательноморфологического направления (Лилли, Барнетт, 1975). Этот новый подход потребовал искусственного выращивания изучаемых организмов, поскольку только таким образом можно проследить онтогенетические изменения грибов «от споры до споры». Однако вопросы физиологии освещались довольно слабо, ограничиваясь обсуждением потребностей грибов, растущих в культуре. Причем особенно пристально изучались паразитические, фитопатогенные грибы, что было связано с запросами практиков. На тот момент уже довольно активно исследовались вопросы физиологии процессов брожения, и, как считают, именно по этой причине дрожжи были изъяты из сферы микологии и отнесены к бактериологии, в которой физиологическое направление было развито более значительно (Курсанов, 1953).

При этом можно с полным правом отметить, что выделение и поддержание чистых культур, как прием работы с грибами, стало формироваться примерно к 80-м годам XIX века.

XX век ознаменовался бурным развитием физиологического направления в микологических исследованиях. Практические разработки были невозможны без теоретических, научных основ, в основе которых лежала работа, прежде всего, с чистой культурой. Эра антибиотиков, безусловно, стимулировала развитие данного направления: ближе к 50-м годам возник конкретный вопрос о практическом использовании чистой культуры в связи с общим прогрессом промышленного культивирования мицелиальных грибов для производства антибиотиков. К отечественным основоположникам физиологии грибов и работы с чистой культурой следует отнести З.Э. Беккер, в монографиях которой приводятся актуальнейшие и ценнейшие сведения о трофике, онтогенезе, особенностях метаболизма грибов в искусственных условиях (Беккер, 1988). Широкое хождение приобретает термин «штамм», который Большая Советская энциклопедия трактует как «…чистая культура определённого вида микроорганизма, у которого изучены морфологические и физиологические особенности» (БСЭ, 1969). Причем под «чистой культурой» понимали потомство одной единственной клетки, то есть клон (Malek, Fencl, 1966).

Теоретические исследования высших базидиомицетов также активизировались в этот период и были связаны с разработкой систематики, экологии, биологии грибов этой группы. Практические работы были направлены на получение мицелиальной биомассы для пищевых и кормовых целей, ценных биологически активных веществ, на использование мицелия для получения плодовых тел. В этот период внедрение и распространение в микологии получает метод глубинной культуры, использовавшийся до этого лишь в микробиологической промышленности. В результате появляются возможности глубинного культивирования не только гифомицетов-продуцентов антибиотиков, но и высших базидиомицетов (Eddy, 1958).

Исследователи приходят к пониманию принципиального значения установления сходства между химическим составом природных плодовых тел и культуральным мицелием, выращенным на элективных питательных средах. Делаются результативные попытки воздействием на условия культивирования добиться улучшения таких важных показателей культивируемого мицелия, как содержание белка, отдельных аминокислот и т.д. (Высшие съедобные базидиомицеты… 1983; Dijkstra, 1976). Многими исследователями отмечалась явная недооценка важности микологических аспектов проблемы глубинного культивирования высших базидиальных грибов, и, в частности, получения чистой культуры. По сведениям А.С. Бухало, вышеуказанная проблема привела к тому, что практически все штаммы базидиальных грибов (гименомицетов), отобранные в 50-70-е годы для промышленного культивирования, оказались несовершенными гифомицетами (Бухало, 1988). Это привело к некоторому пессимизму в оценке возможного использования высших съедобных базидиомицетов в качестве продуцентов биомассы и затормозило исследования в этой области. Более того, на тот момент возникла ложная концепция, утверждающая, что в культуре образуются физиологические мутанты с несвойственными высшим базидиомицетам спороношениями. Таким образом, возникла насущная необходимость разработки культуральных приемов идентификации (Nobles, 1948, 1965).

Именно в чистой культуре возможно и необходимо проведение описания культурально-морфологических признаков штаммов. Первая большая работа в этом направлении проведена чешским микологом М. Семерджиевой (Semerdgieva, 1965; Семерджиева, 1977, 1984). Работы этого автора, посвященные изучению культурально-морфологических признаков гименомицетов в условиях чистой культуры, вышли в свет значительно раньше, чем широко известная и рекордное количество раз цитируемая специалистами этого направления работа Дж. Сталперса (Stalpers, 1978). Работы Дж. Сталперса содержат примеры описания колоний высших базидиомицетов. Классификация типов мицелиальных колоний в соответствии с подходами этого автора активно используется при характеристике культуральноморфологических свойств различных штаммов.

Несомненно, огромнейший вклад в развитие приемов лабораторного и промышленного культивирования высших базидиомицетов внесли А.С. Бухало, И.А. Дудка, Н.А. Бисько, В.И. Билай. В их многочисленных монографиях содержится вся необходимая практическим микологам информация о работе с чистой культурой (Билай и др., 1983; Высшие съедобные базидиомицеты…1983; Бисько и др., 1986; Бухало, 1988; Дудка и др., 1992; Бисько и др., 2001, 2010). Для более полного описания культуральноморфологических особенностей штаммов А.С. Бухало предложено использовать расчетный показатель РК (ростовой коэффициент), который, кроме скорости роста учитывает и такие важные показатели, как интенсивность формирования воздушного мицелия. Сборники под редакцией В.И. Билай содержат описания методов изучения морфологии, физиологии, биохимии грибов, в том числе данные о жизнедеятельности культур грибов в экстремальных условиях (Методы экспериментальной микологии, 1973, 1982). Общим контекстом, объединяющим работы, выступает утверждение о том, что экспериментальное изучение высших базидиальных грибов стало возможным только благодаря разработке доступных методов получения чистых культур этих грибов. Этот момент в развитии экспериментальной микологии можно считать периодом окончательного осознания исключительного статуса чистой культуры.

Интенсификация микологических исследований в условиях чистой культуры в последней четверти XX века связана с развитием и распространением любительского и промышленного грибоводства. В этом контексте несколько иное понимание получает термин «штамм», который подразумевает в практическом грибоводстве чистую генетическую линию, которая может быть получена путем вегетативного иссечения изолята из плодового тела. Таким образом, возникает синонимика между понятиями штамм и изолят. Именно в этом направлении практической микологии возникают такие термины, как маточная, посевная культура. Так, в ряде рекомендаций по выращиванию посевного мицелия с целью использования в практическом грибоводстве, отмечается: «Штамм – чистая культура грибов, отличающаяся особыми признаками и ценными свойствами. Штамм размножают не спорами, а с помощью "чистой культуры" (она же стволовая, она же маточная культура), и здесь уже имеется в виду именно чистота в смысле генетической чистоты линии штамма» (Рекомендации…1983).

В наших исследованиях мы придерживаемся следующей трактовки определения «штамм»: чистая культура определенного вида, выделенная из базидиомы (или базидиом, растущих совместно), тканевым или споровым способом, для которой изучены культурально-морфологические свойства и особенности микроморфологии. В зависимости от способа выделения и прочих особенностей могут различаться ди- и монокариотические штаммы, тканевые и споровые изоляты.

Ведение научных исследований, в том числе, селекционная работа, для обеспечения генетической чистоты материала, часто предполагает выделение не изолята, а именно моноспоровой культуры – культуры гриба, полученной из одной споры, что обеспечивает работу с генетически чистым материалом. К использованию таких культур прибегают при изучении физиологической разнородности особей гомоталличных видов в пределах вида, штамма или расы, при изучении изменчивости, установления цикла развития, скрещивании и т.д. Моноспоровую культуру получают методом серийного разведения или с помощью микроманипулятора (Камзолкина, 1996). Для выделения моноспоровых культур методом серийного разведения вначале получают споровые отпечатки из спорулирующих плодовых тел.

Определенный вклад в развитие отечественного грибоводства внесла монография Дворниной А. А. «Базидиальные грибы в искусственной культуре», вышедшая в 1991 году. Особое место в исследованиях базидиальных грибов было отведено возможности получения грибной биомассы на жидких питательных средах при глубинном культивировании (Дворнина, 1990; Кожемякина и др., 2008).

В современный период все большую актуальность приобретают исследования, связанные с изучением in vitro базидиальных макромицетов – продуцентов биологически активных веществ, используемых для профилактики и лечения заболеваний человека. Это вещества различной химической природы, в основной своей массе являющиеся вторичными метаболитами грибов названной группы. Различные стороны биохимии и физиологии видов – продуцентов изучаются, в основном, в условиях чистой культуры (Гарибова и др., 1999; Феофилова и др., 1994, 1996, 1998, 2000; Феофилова и др., 1994, 1998; Гарибова и др., 2003; Краснопольская и др., 2003;Бабицкая и др., 2007; Соболева и др., 2007; Соболева, 2010; Wasser, Weis, 1999; Smith et al., 2002; Wasser, 2002; Roberts, 2006). В частности, скрининг перспективных штаммов, анализ разных сторон вторичного метаболизма проводится с использованием именно лабораторного культивирования мицелия (Завьялова и др., 2005; Ильина и др., 2009; Постнова, 2009). Результаты экспериментов, полученных при работах с чистыми культурами, имеют большое научно-практическое значение. Признано, что использование именно быстро наращиваемого мицелия (например, глубинного) для получения ценных метаболитов в большинстве случаев выгоднее и удобнее, чем использование плодовых тел (Краснопольская и др., 2005; Автономова и др., 2006; Автономова, Краснопольская, 2007; Краснопольская и др., 2008)). Многие активные начала идентифицированы в культуральной жидкости, то есть они в принципе не могли быть получены «в обход» чистой культуры.

Таким образом, следует признать исключительность статуса чистой культуры в микологических исследованиях, связанных с изучением самых разных сторон жизнедеятельности грибов.

Одним из первостепенных приемов, предваряющих любые лабораторные исследования, связанные с микроорганизмами, является выделение и поддержание чистых культур, что подразумевает создание коллекции. Коллекции микроорганизмов создаются в разных целях: для более глубокого познания разнообразия микробного мира, населяющего разные природные субстраты, изучения биологических особенностей разных видов, их функциональных различий, а также извлечения из каждого вида той пользы, которая в закодированном виде содержится в геноме (Лугаускас, Репечкене, 2002). Поэтому объем и специфика коллекций определяются, безусловно, целями исследований и направлениями научных изысканий. Практика создания коллекций культур микроорганизмов имеет давнюю историю. Естественно, что поддержание чистых культур в составе коллекций стало возможным лишь с появлением специальных средств (холодильные установки, стерилизаторы и т.п.). XX век был ознаменован бурным развитием коллекций культур микроорганизмов во всем мире, в связи с чем скоро возникла необходимость их общей систематизации. Наиболее существенные итоги работы коллекций культур в Европе и в мире были подведены в 1981 году, в г. Брно (ЧССР), где с 20 по 24 июля проходила IV Международная конференция по коллекциям культур. Конференция была организованная Всемирной федерацией по коллекциям культур (WFCC), Чехословацкой коллекцией микроорганизмов (ССМ) при Университете Пуркине, Брно и Чехословацким микробиологическим обществом. Доклады, сделанные 250 представителями из 42 стран мира касались роли культур в науке, образовании, медицине и промышленности; хранения культур; биоопасности в коллекциях и их контроля; методов выделения и очистки культур. Подробный анализ деятельности конференции сделан Л.А. Беляковой и В.М. Благодатской (Белякова, Благодатская, 1983). В работе дан обзор состояния и деятельности существующих на тот момент европейских коллекций культур микроорганизмов: основанной в 1963 году Чехословацкой коллекции микроорганизмов (ССМ) при Университете Пуркине, г. Брно; созданной в 1964-1965 годах коллекции культур грибов (CCF) Карлова Университета в г. Праге; Чехословацкой коллекции культур грибов, разрушающих древесину, организованной еще в 1948 году в г. Братиславе профессором Рипачеком; богатой штаммами базидиомицетов коллекции культур (CBS) в г. Баарне, Нидерланды; коллекции Микологического института (CMI), г. Кью, Англия, основанной в 1947 году; коллекции культур высших грибов в г. Веймаре, Германия; наконец, коллекции культур базидиальных грибов Норвежского лесного исследовательского института, основанной в 1937 году. Большой объем информации имеется по коллекциям дрожжей.

За период, прошедший с момента опубликования этих данных, в связи с интенсификацией этого направления науки, а также с грандиозным расширением информационных возможностей, в мире было создано множество коллекций самой разной направленности, а также единая справочная система: Всемирный справочник коллекций культур (World Data Center of microorganism, WDCM). В настоящий момент в справочнике содержится информация о 568 коллекциях культур в 68 зарегистрированных в WDCM странах. По данным статистики, среди 1534400 единиц культур, содержащихся в них, на первом месте бактериальные (684202 единиц), а на втором – грибные (488860 единиц). Микологические коллекции содержат в целом 25186 видов и подвидов грибов (http://wdcm.nig.ac.jp/CCINFO.xml31). Для микологов и биотехнологов, работающих с культурами грибов, наибольший интерес представляют именно микологические специализированные коллекции. Среди таких коллекций, зарегистрированных в WDCM, можно отметить (приводятся акроним и название коллекции): IIB-INTECH, Collection of Fungal cultures (Аргентина); RCDM, Republican Centre for Deposition of Microorganisms of the National Academy of Sciences and Ministry of Education and Science of Armenia (Армения); ACH, Mycology Culture Collection (Австралия); ACBR, Austrian Center of Biological Resources and Applied Mycology (Автрия); CCB, Colecao de Culturas de Basidiomicetos (Бразилия); CCFC, Canadian Collection of Fungal Cultures (Канада); CCBAS, Culture Collection of Basidiomycetes (Греция); IBT, IBT Culture Collection of Fungi (Дания); TFC, Tartu Fungal Culture Collection (Эстония); LCP, Fungal Strain Collection, Laboratory of Cryptogamy (Франция); FSU PRZ, Pilz-Referenz-Zentrum (Fungal Reference Centre) Jena (Германия); PPIHAS, Mycology Collection (Венгрия); NFCCI, National Fungal Culture Collection of India и VPCI, Fungal Culture Collection (Индия); IRAN, Iranian Fungal Culture Collection (Иран); TAUFCC, Fungal Culture Collection (Израиль); TIMM, Institute of Medical Mycology и TSY Laboratory of Mycology, Division of Microbiology (Япония); CCARM, Culture Collection of Antimirobial Resistant Microorganisms и CCWM, Culture Collection of Wild Mushroom (Корея); BMFM-UNAM, Culture Collection of Fungal Pathogens Strains from the Basic Mycology Laboratory of the Department of Microbiology and Parasitology Faculty of Medicine (Мексика); CBS, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Fungal and Yeast Collection (Нидерланды); FCBP, First fungal culture bank of Pakistan и NFCCP, National Fungal Culture Collection оf Pakistan (Пакистан); PPRI, National Collection of Fungi: Culture Collection (ЮАР); FCUG, Fungal Cultures University of Goteborg (Швеция); NCWRF, National Collection of Wood Rotting Fungi (Англия); FGSC Fungal Genetics Stock Center (США).

В настоящее время большинство коллекций в Европе являются членами ECCO (Европейской организации коллекций культур), часть из них выступает в качестве международных депозитариев (International Depositari Authorities, IDA). К их числу относится наиболее крупная коллекция Российской Федерации – Всероссийская коллекция микроорганизмов ВКМ (VKM) (Кочкина, 1996). География ВКМ охватывает практически всю территорию России, коллекции, представленные в разных городах, имеют самую разнообразную направленность: коллекции клеточных и тканевых культур, зоо- и фитопатогенных организмов, вирусов, бактерий, грибов самых разных таксономических групп (рис. 1). Всероссийская коллекция микроорганизмов (ВКМИБФМ РАН) в течение ряда лет является ведущей организацией по Федеральной научной программе «Биоразнообразие» (основное направление – «Коллекции живых культур») (Озерская и др., 2002). По итогам выполнения программы создан сводный каталог культур микроорганизмов российских коллекций, включающий и мицелиальные грибы. В настоящее время в России действуют 14 грибных коллекций, 10 из которых участвовали в данной программе. Совокупный фонд поддерживаемых в коллекциях России грибных культур составляет в настоящее время около 8000 штаммов, большая часть которых помещена в сводный каталог. Видовое разнообразие грибов, поддерживаемых в коллекциях России, сейчас насчитывает примерно 1700 видов, относящихся к 489 родам.

Рисунок 1 – Города на территории Российской Федерации, в которых поддерживаются коллекции культур, входящие в ВКМ: Архангельск, Санкт-Петербург, Благовещенск, Владивосток, Хабаровск, Якутск, Ростовна-Дону, Краснодар, Иркутск, Улан-Удэ, Новосибирск, Томск, Красноярск, Омск, Смоленск, Курск, Москва, Саратов, Волгоград, Гатчина, Тверь, Екатеринбург, Пермь, Уфа, Казань, Сыктывкар, Пущино, Оболенск, Нижний Новгород, Борок, Углич, Торжок, Покров, Юрьевец (по данным сайта http: //www.sevin.ru/collections/microcoll/ reg.28.html).

При этом отмечено увеличение совокупного фонда грибов на 3000 штаммов по сравнению с ВКМ, а разнообразие его – почти на 500 видов. Большая часть этого разнообразия представлена в коллекциях институтов Академии наук РФ, что объясняется, в первую очередь, стремлением исследователей к сохранению вискусственных условиях максимально возможного разнообразия выделяемых культур. Для коллекций прикладных институтов (таких как ВКПМ, ВНИИА, ВНИИПАКК) более характерно сохранение и поддержание продуцентов известных метаболитов, что приводит к ограничению разнообразия фондов несколькими десятками известных своими потенциальными возможностями родов грибов.

Среди коллекций чистых культур, ориентированных именно на высшие базидиальные грибы, в первую очередь надо отметить коллекцию культур высших базидиальных грибов Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН (ЛЕ БИН, LE BIN), существующую с 1955 года. В первом каталоге коллекции, опубликованном в 1992 году, насчитывалось 470 штаммов базидиальных грибов, представленных 126 родами и 300 видами (Каталог… 1992). При описании штаммов даны латинское название, автор, впервые описавший вид, синонимы, номер штамма в коллекции, место сбора исходного материала, год выделения в культуру. Для штаммов из других учреждений указаны отправитель, исходный номер, год поступления. Во втором издании каталога (Каталог… 2007) представлена информация уже о 1463 штаммах макромицетов, относящихся к 530 видам, 200 родам, 55 семействам и 24 порядкам агарикоидных, афиллофороидных, гастероидных, а также сумчатых грибов. Объем таксонов при систематизации каталога соответствует системе, принятой в 9 издании Словаря грибов Айнсворта и Бисби (2001). Таким образом, в коллекции LE BIN сохраняется примерно десятая часть природного видового разнообразия базидиомицетов России. Штаммы грибов из коллекции активно используются для исследовательских работ по физиологии, биохимии, генетике грибов (Псурцева и др, 1994, 2010). В коллекции депонируются штаммы продуцентов биологически активных соединений.

Среди значительных коллекций высших базидиальных грибов в странах ближнего зарубежья следует, прежде всего, отметить созданную в 1970-х годах коллекцию Института ботаники им. М.Г. Холодного НАН Украины; Она отнесена к категории объектов национального достояния Украины и имеет государственную финансовую поддержку. Большое внимание уделяется созданию в Коллекции таксономического и штаммового разнообразия преимущественно съедобных и лекарственных макромицетов. К концу 2001 г. в Коллекции поддерживалось более 750 штаммов, которые относятся к 200 видам 98 родов. Важным направлением работы Коллекции является интродукция в культуру и сохранение генофонда редких видов шляпочных грибов и таких, которые исчезают вследствие чрезмерного сбора населением. За последние годы большое внимание уделялось созданию биоразнообразия лекарственных грибов, которые в Коллекции представлены свыше 100 видами. Виды, относящиеся к родам: Pleurotus, Agaricus, Lentinus, Oudemansiella, Flammulina, Hericium, Piptoporus, Omphalotus, Schizophyllum, Ganoderma, Laetiporus, Lycoperdon, Coprinus, Macrolepiota и пр. представлены в Коллекции значительным штаммовым разнообразием (Каталог колекцii…2001).

Основу коллекции культур высших базидиальных грибов кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова составляют культуры рода Agaricus, а также представлены культуры многих видов дереворазрушающих базидиомицетов (Гарибова и др., 2007).

В последнее время активно обсуждается необходимость издания и своевременного пополнения каталогов культур. Каталоги коллекций культур являются ключевым звеном во взаимодействии коллекций культур с профессиональным сообществом с одной стороны, сообществом потенциальных пользователей культурами и информацией о них – с другой. Позиция профессионального сообщества кратко выражена в тезисе комитета Всемирной Федерации коллекций культур (WFCC) по коллекциям, находящимся под угрозой исчезновения: “нет каталога – нет и вопроса о существовании коллекции” (http://www.sevin.ru/collections/microcoll/reg. 28.html). С точки зрения пользователей, все большее значение приобретают сводные каталоги, позволяющие в ходе одного “электронного визита” оценить весь спектр доступных культур и информации о них – в том числе по странам, регионам и т.д. Участие в составлении сводных каталогов позволяет сотрудникам коллекций автоматически отслеживать и устранять случаи дублирования культур в поддерживаемых фондах, реагировать на те быстрые изменения, которые непрерывно происходят в таксономии и номенклатуре поддерживаемых микроорганизмов. В последние годы с целью облегчения поиска необходимых для исследования культур грибов, была разработана специализированная база данных, получившая название FungalDC–Fungal Diversity in Culture Collection (разнообразие грибов в коллекциях культур). База данных содержит информацию о 24563-х видах и 16843 родах грибов, представленных в 10-м издании микологического словаря (http://www.indexfungorum.org/ Names/Fundic.asp). Особенность новой базы, размещенной на сайте Всероссийской коллекции микроорганизмов (www.vkm.ru\fungal DC. htm) в том, что она содержит списки видов грибов, поддерживаемых в фондах 260 коллекций мира, что позволяет пользователям сразу получать информацию о наличии нужных культур и выбрать коллекцию, наиболее удобную для получения штаммов (Озерская и др., 2010).

В предисловии ко второму изданию каталога коллекции культур базидиомицетов LE (BIN) Ботанического Института им. В.Л. Комарова, говорится: «Коллекции живых культур грибов – уникальный фонд грибных организмов, выделенных из природных экосистем. В коллекциях поддерживаются в живом состоянии представители различных таксонов в их фено- и генотипическом разнообразии. Сохраняемые культуры – важнейший источник для морфологических, физиологических, биохимических и генетических исследований, которые являются основой для развития фундаментальной и прикладной науки… а также открывают возможности для реинтродукции редких и исчезающих видов грибов в естественные сообщества» (Psurtseva et al., 2007). Прикладное и общетеоретическое значение коллекций мицелиальных культур грибов разных систематических групп сложно переоценить. Базидиальные макромицеты – одна из самых уязвимых групп по отношению к антропогенному воздействию. Исследователи, работающие с этими организмами, отмечают, что высшие базидиомицеты – это группа мицелиальных, слабо спорулирующих или совсем не спорулирующих (отсутствие анаморф) грибов и поэтому для их выделения, поддержания в коллекциях требуются особые подходы и методы (Гарибова и др., 2007). О важной роли коллекций чистых культур для решения проблемы сохранения биоразнообразия свидетельствуют тематический сборник «Биоразнообразие микроорганизмов: роль центров микробных ресурсов (ed. Kirsop, 1994), выпущенный Всемирной федерацией коллекций культур (WFCC), (цит. по Озерской, 1996) и справочник «Европейские коллекции культур: микробное разнообразие в надежных руках» (ed. M.L. Suchko, 1995), опубликованный Европейской организацией коллекций культур (ECCO), (цит. по Кочкиной, 1996). Таким образом, коллекция – это и способ сохранения генофонда редких и исчезающих видов, скрининга штаммов с ценными свойствами и материал для проведения селекционной работы. В этой связи, особую роль способны сыграть региональные коллекции, представительство культур в которых формируется в основном из характерных для региона видов. Региональные особенности формируют параметры экосистем, что определяет спектр видов микобиоты, их характерные трофические связи (Гарибова, Ильина, 2009). На этом основании можно предполагать нахождение штаммов с уникальными свойствами, отличающими региональные образцы от таковых иного происхождения. Кроме того, нередко возникают ситуации, когда при составлении региональных Красных книг в статус редких попадают виды, для которых территория данного региона представляет собой либо границу ареала (что определяет пессимальные условия), либо их представительство носит экстразональный характер. Включение таких видов в состав коллекции для изучения их экологических особенностей не только в природных, но и в лабораторных условиях, позволит выяснить их истинный статус.

1.2 Трофические потребности ксилотрофных базидиомицетов в условиях чистой культуры

Культуры базидиомицетов, выделенные из естественных мест обитания и культивируемые затем в лабораториях, попадают при этом, как правило, в несвойственные для них условия существования. В лабораториях большинство микроорганизмов поддерживается и изучается в виде чистых культур, то есть в таком состоянии, в котором эти организмы природе никогда не встречаются. Развитие грибов в природном субстрате происходит зонами, микроколониями, в окружении организмов других видов. Многие клетки, споры вегетативного, бесполого и полового спороношения адсорбируются механическими частицами, находятся в иммобилизованном состоянии, обладая при этом свойствами, отличными от свободно живущих клеток. Отличие состоит также и в том, что при культивировании организмов в виде чистых культур исключается возможность влияния на них других организмов, не проявляется благоприятное или, наоборот, вредное действие продуктов жизнедеятельности других организмов, продуктов распада отмерших клеток других видов. В условиях лабораторного культивирования микроорганизмы нередко попадают в исключительно благоприятные условия питания; для них подбираются оптимальная температура развития, благоприятная для роста влажность, кислотность среды и другие факторы, которых организм обычно не имеет в естественных местах обитания.

Организмы, выделенные из природы и перенесенные в лабораторные условия, – это, по выражению Виноградского, «одомашненные, тепличные организмы» (Егоров, Самуилов, 1997; Егоров, 1988).

При культивировании грибов в лабораториях обычно имеет место развитие их в ограниченном пространстве. Все это способствует тому, что физиологическая деятельность микроорганизмов, находящихся в условиях лабораторного культивирования, значительно отличается от их деятельности при развитии, например, на древесном субстрате.

Таким образом, при лабораторном культивировании микроорганизмов на проявление их физиолого-биохимического потенциала могут влиять совершенно иные факторы, другие закономерности по сравнению с теми, которые имеют место в природе. Условия, искусственно создаваемые для развития организмов, можно легко контролировать, что позволяет определять роль и влияние отдельных факторов на рост, развитие изучаемого микроба и проявление им различных биохимических, в том числе и продукционных свойств.

К числу наиболее существенных факторов, оказывающих влияние на проявление ценных свойств микроорганизмов, реализацию их природного потенциала относятся состав среды, концентрация протонов водорода, редокс-потенциал, температура культивирования, методы совместного выращивания двух или большего числа видов микроорганизмов и другие факторы, иными словами, весь сложный комплекс условий культивирования микроорганизмов. При этом к важнейшим факторам, определяющим активность гетеротрофных организмов, следует отнести, прежде всего, наличие в среде элементов питания. Оптимальный состав питательной среды для каждого продуцента (биомассы или вторичных метаболитов) или коллекционной культуры может быть определен двумя способами: эмпирический и построение математической модели с использованием пакетов компьютерных программ. Последний способ, как наиболее объективный и статистически точный является более предпочтительным (Егоров, 1988). Основной принцип составления рецептур питательных сред – удовлетворение физиологических потребностей микроорганизмов. В каталогах культур и в определителях указаны эти потребности, а также оптимальные значения рН и температуры. Задача специалиста, оптимизирующего состав среды для конкретного штамма – продуцента целевого продукта, – выбрать из перечня источников углерода, азота, фосфора и других веществ наиболее оправданные в экономическом и экологическом отношении компоненты. С этой целью проводят лабораторные опыты, желательно с использованием методов математического планирования эксперимента. Отдельным, не менее важным вопросом является разработка питательных сред для коллекционных культур. Здесь требуется, с учетом индивидуальных особенностей сохраняемых культур, не только создать соответствующие условия температуры и влажности, способствующие замедлению процессов метаболизма, но подобрать «пролонгированные» источники питательных веществ, компоненты которых должны обеспечивать защиту от окислительного стресса и обеспечивать существование живой культуры в течение длительного времени (Ильин, Ильина, 2003).

В питании базидиальных грибов главную роль играют соединения, содержащие углерод, так как служат двум основным функциям в метаболизме этих организмов: снабжают собственно углеродом, необходимым для синтеза веществ живых клеток и участвуют в процессах окисления, где являются единственным источником энергии (Курсанов, 1940; Шиврина, 1965). Благодаря различной химической природе, благодаря неодинаковой степени окисленности, разные источники углерода сами по себе также оказывают существенное влияние на развитие микроорганизмов и, следовательно, на образование ими метаболитов.

Наилучшим образом роль различных источников углерода в качестве компонентов питательной среды освещена в применении к продуцентам антибиотиков. При этом многими исследователями выявлено, что тот или иной источник углерода способен обеспечить нормальный рост микроорганизма, но подавляет синтез антибиотика, другие – наоборот. Например, при развитии Penicillium chrysogenum (продуцента пенициллина) лактоза используется организмом медленнее, чем глюкоза, и это сказывается на выходе антибиотика. Если в среде в качестве источника углерода присутствует только глюкоза, то все обменные процессы, осуществляемые грибом, ускоряются. В этих условиях максимум образования пенициллина происходит приблизительно через 50 ч развития культуры, вследствие чего уровень биосинтеза антибиотика остается низким. В присутствии же лактозы максимум образования антибиотика происходит через 150 – 160 ч и это способствует повышению выхода пенициллина. Поэтому на практике для получения пенициллина обычно используют одновременно и глюкозу и лактозу, что обеспечивает хорошее развитие гриба и высокий уровень биосинтеза пенициллина.

К сожалению, таких данных, отражающих результаты исследований по значению различных источников азота для культур ксилотрофных базидиомицетов относительно немного. Без сомнения, высшие базидиомицеты, представляющие собой различные экологические группы, в природе сталкиваются с большим разнообразием углеводов, чаще всего с полимерными формами простых сахаров. В монографии А.С. Бухало (1988) сделан обзор зарубежных и отечественных исследований по вопросу предпочтений высшими базидиомицетами различных источников углерода при искусственном культивировании. Все источники свидетельствуют, что высшие базидиомицеты в культуре предпочитают сахара другим источникам углерода. Существует мнение, что глюкоза является универсальным источником углерода для всех высших базидиомицетов, хотя она и не всегда обеспечивает максимальный рост мицелия. Для большинства этих грибов таким же хорошим источником углерода, как глюкоза, служит фруктоза (Шиврина и др., 1969; Berry, 1975). Многие дереворазрушающие грибы из пентоз хорошо используют ксилозу, в то время как арабиноза утилизируется ими очень слабо (Fries, 1955; Worgan, 1968; Berry, 1975). Для многих базидиомицетов из спиртов пригодны маннит и глицерин (Шиврина и др., 1969; Бухало и др., 1972; Маслова, 1973; Berry, 1975; Gupta, Pathak, 1982). Всеми высшими базидиомицетами из дисахаридов потребляются мальтоза и целлобиоза. Сахароза не является универсальным источником углерода для этих грибов, а лактоза используется наименьшим количеством исследованных штаммов (Шиврина и др., 1969; Маслова, 1973; Johri, Brodie, 1972; Berry, 1975). Наилучшим источником углерода для ряда видов является крахмал (Fries, 1955; Worgan, 1968; Маслова, 1973; Sakamoto et al., 1978a, b). Для видов родов Tricholoma, Agaricus хорошим источником углерода служат пектиновые вещества, хуже усваиваются декстрины (Treschov, 1944; Fries, 1955; Worgan, 1968; Oyama et al., 1974).

Безусловную ценность представляют работы под руководством А.С. Бухало, посвященные изучению роли источника углерода при искусственном культивировании ксилотрофных базидиомицетов (1988). В качестве единственного источника углерода на синтетической среде были испытаны моносахариды – ксилоза, глюкоза, галактоза; дисахариды – сахароза, мальтоза, лактоза; трисахарид – рафиноза; полисахариды – крахмал, сахароза; спирт – маннит. Контролем служила питательная среда с глюкозой. Кроме того, в качестве источника углеродного питания были испытаны целлюлоза, лигнин и неуглеводные источники – мягкий парафин и этанол. Интенсивность роста исследованных видов, культивированных на питательных средах с разными источниками углерода, значительно отличалась. Так, Panus tigrinus, Flammulina velutipes и Kuehneromyces mutabilis лучше усваивали ксилозу по сравнению с глюкозой, однако большинство видов хуже росли на питательной среде с ксилозой. Глюкоза оказалась наилучшим источником углерода для Armillaria mellea и Pholiota adiposa. Большее количество биомассы на среде с галактозой, чем на среде с глюкозой, образовывали Schizophyllum commune, Panus tigrinus, Coprinus comatus, Agaricus silvaticus и другие виды. Из испытанных дисахаридов лучше использовалась мальтоза. Более активно, чем на других источниках углерода, на ней росли Schizophyllum commune, Panus tigrinus, Pholiota aurivella. Лактоза и рафиноза усваивались хуже, чем другие источники углерода. Многие испытанные виды – Kuehneromyces mutabilis, Panus tigrinus и другие глюкозе предпочитали крахмал (Бухало, 1988). Данные, полученные при культивировании Crinipellis schevczenkovii, свидетельствуют, что из 13 исследованных источников углерода (глюкоза, арабиноза, ксилоза, манноза, фруктоза, лактоза, мальтоза, сахароза, маннит, сорбит, крахмал, целлюлоза) лучшими для роста гриба и синтеза им полисахаридов являются глюкоза и крахмал (Бабицкая и др., 2005).

Усвоение высшими базидиомицетами углеводородов в литературе освещено неполно. Т. Сугимори с соавторами (Sugimori et al., 1971) приводят данные об использовании высшими базидиомицетами, в том числе Pteurotus ostreatus, Flammuiina velutipes, Lentinus edodes и Schizophyllum commune, неуглеводных источников углерода: алифатических спиртов, алканов, органических кислот трикарбонового цикла. На мягком парафине в качестве источника углерода растут Coriolus zonatus, Schizophyllum commune, Armillarieila mellea, Hirneola auricula-judae, Pholiota aurivella, Pleurotus ostreatus (Bilai et al., 1968; Билай, Коваль, 1980; Бухало, 1988; Антоненко, 2009).

Древоразрушающие базидиомицеты в природе принимают участие в разложении целлюлозы и хорошо используют этот высокомолекулярный углевод при искусственном культивировании. Многие виды активно растут на среде с фильтровальной бумагой в качестве единственного источника углерода. К ним относятся лигнотрофние виды из родов Panus, Pieurotus, Flammulina, Pholiota и Schizophyllum (Бухало, 1988). Автор цитируемой монографии свидетельствует, что наиболее высокой активностью целлюлозолитических ферментов характеризуются виды, приуроченные в природе к целлюлозосодержащим субстратам: Panus tigrinus, Pleurotus ostreatus, Flammulina velutipes, Crinipellis schevczenkovi и Armillarieila mellea.

Лигнин используется грибами белой гнили в природе. Однако в культуре для усвоения грибами он должен находиться в доступной форме, и грибы, как правило, должны быть к нему адаптированы (Шиврина и др., 1969; Berry, 1975). Проблема такой адаптации, а также получения соответствующих форм лигнина мало освещена в литературе.

Особенности содержания тех или иных функциональных групп в различных видах лигнина довольно подробно освещены в целом ряде специальных монографий (Грушников, Елкин, 1973; Закис, 1987). В качестве примера, иллюстрирующего разнообразие функциональных групп в препарате, который принято считать наиболее близким к природному лигнину еловой древесины, следует привести гипотетическую структурную формулу фрагмента макромолекулы лигнина Бьёркмана, предложенную Фрейденбергом (1969) (рис. 2).

Рисунок 2 – Гипотетическая структурная формула фрагмента макромолекулы лигнина хвойной древесины (по Freudenberg, 1968)

Схема эта, конечно же, не претендует на абсолютно точное отображение истинного строения макромолекулы лигнина, но наиболее удовлетворительно согласуется с аналитическими данными и позволяет объяснить многие реакции лигнина и его трофическую значимость для грибов белой гнили. Согласно формуле Фрейденберга, в природном (in situ) лигнине присутствуют следующие функциональные группы: метоксильные, фенольные гидроксильные, первичные и вторичные алифатические гидроксильные, кетонные и альдегидные (Азаров и др.,1999; Айзенштат, Боголицин, 2009). В других видах и препаратах лигнина количество групп будет иным. В зависимости от способа выделения и обработки препарата, особенно при химическом модифицировании, в нем могут появляться и другие, не свойственные природному лигнину группы.

Вопрос о том, является ли лигнин источником энергии для грибов, способен ли лигнин хотя бы отчасти обеспечивать энергетические и ростовые потребности этих организмов, является дискуссионным. По мнению Т.К. Кирка, лигнин не следует рассматривать как источник энергии, а его деструкция древоразрушающими грибами белой гнили является лишь частью вторичного метаболизма (Kirk, 1981). Существуют подобные обзоры, посвященные процессам биодеградации лигнина (Решетникова, 1997; Головлева, Леонтьевский, 1998; Eriksson et al., 1990; Hattaka, Vares, 1994). На основе существующих данных, выделяют следующие группы реакций, приводящих к деструкции макромолекулы лигнина:

– окисление боковых цепей лигнина по α- и β- углеродным атомам с образованием структур, содержащих кетогруппы, а также с образованием фенольных структур;

– гидролитическое расщепление β-О-4 эфирных связей с образованием спиртовых и фенольных структур;

– разрушение алкиларильных С-С-связей, образование nхиноидных структур и альдегидных или кислотных фрагментов;

– деметилирование и гидроксилирование ароматического кольца;

– расщепление ароматического кольца с образованием алифатических продуктов, чаще всего карбоновых кислот (Решетникова, 1997).

Исходя из приведенных данных, следует предполагать включение углерода метоксильных и других групп в метаболические процессы грибов, способных к деструкции лигнина. Исходя из цитируемой многими литературными источниками связи процессов окисления лигнина с реакциями вторичного метаболизма, можно предполагать и наличие в определенной степени регуляторной роли со стороны лигнина и промежуточных соединений, образующихся в процессе его деструкции (вератровый спирт и т.п.).

Изменения в лигнине при деструкции грибами белой гнили изучали химическими методами, а также с помощью УФ-, ИКи ПМР-спектроскопии с последующей качественной оценкой (Fengel, Wegener, 1979; Dietrichs et al., 1995). Установлено, что под действием грибов белой гнили в лигнине увеличивается содержание карбонильных и карбоксильных групп и уменьшается содержание алифатических гидроксильных групп. Содержание фенольных гидроксилов может и возрастать и понижаться. Отношение кислорода к углероду увеличивается, а водорода к углероду и метоксильных групп к углероду понижается. Уменьшаются также выходы метоксилированных ароматических кислот при окислительной деструкции после метилирования (вератровой кислоты из хвойного лигнина и вератровой и три-О-метилгалловой кислот из лиственного лигнина) и продуктов нитробензольного окисления (ванилина из хвойного лигнина и суммы ванилина и сиреневого альдегида из лиственного лигнина). Уменьшается выход продуктов ацидолиза и их число. Из лигнина здоровой древесины в качестве основного продукта ацидолиза получается 3гидрокси-1-(4-гидрокси-3-метоксифенил) -2-пропанон, тогда как из гнилого лигнина – ванилиновая кислота.

После воздействия грибов возрастает массовая доля кислорода и понижается содержание метоксильных групп (Фенгел, Вегенер, 1988). Увеличение содержания кислорода происходит в результате окисления α-углеродных атомов и окислительной деструкции связей между β- и γ-углеродными атомами пропановой цепи (Fengel, Wegener, 1979). Модельные опыты с различными метоксилированными фенолами показали, что грибы белой гнили деметилируют метоксильные группы. Опыты с меченым (¹⁴С) лигнином свидетельствуют, что при разложении лигнина грибами белой гнили (Coriolus versicolor, Phanerochaete chrysosporium) конечный продукт метаболизма СО₂ образуется главным образом из метоксильных групп и в небольшой степени из углерода пропановых цепей и ароматических колец (Фенгел, Вегенер, 1988). Таким образом, практически не остается сомнений относительно включения функциональных групп лигнина в метаболические процессы грибов белой гнили.

Дальнейшие реакции приводят к получению мономерных и димерных соединений, большинство из которых содержат карбоксильные группы. Для включения этих соединений во внутренний обмен веществ гриба необходимо также, по-видимому, и расщепление ароматических колец. Среди ферментов грибов идентифицировали диоксигеназы, осуществляющие деметилирование ванилиновой и вератровой кислот – мономеров, которые были найдены в продуктах деструкции лигнина под действием грибов (рис. 3) (Chen et al., 1981).

Рисунок 3 – Окислительное расщепление ванилиново й кислоты под действием диоксигеназ

Расщепление ароматических колец возможно не только у мономерных продуктов деструкции. Ароматические кольца в лигнинном полимере также, по-видимому, расщепляются ферментами (Kirk et al., 1976; Chen et al., 1981).

На расщепление ароматических колец указывают ¹³С-ЯМРспектры искусственного лигнина, зараженного грибами белой гнили. Происходит также разрыв арилэфирных связей и расщепление пропановых цепей. Изменение состава продуктов ацидолиза древесины березы, пораженной белой гнилью, позволило заключить, что деструкция лигнина происходит на пораженной поверхности, которая прогрессирующе увеличивается. Макромолекулы практически не подвергаются фрагментации. Процесс деструкции заключается в отщеплении концевых групп (Фенгел, Вегенер, 1988).

Лигнин, очевидно, включается в метаболизм грибов не полностью, так как некоторая часть его превращается в высоко-конденсированный продукт. Реакции, обратные ферментативной деструкции, обнаружили и при выращивании грибов Heterobasidion annosum и Coriolus versicolor на лигнине молотой древесины, сульфатном лигнине и лигносульфонатах (Cote, 1968). Модельные эксперименты указывают на образование бифенильных структур в результате ферментативной дегидратации. Эту реакцию, по-видимому, вызывает лакказа, так как добавка ингибиторов лакказы предотвращает конденсацию. Добавление целлюлозы к культуре Pleurotus ostreatus на лигносульфонатах ингибировало реакции образования полимеров (Crawford, 1981). Целлюлоза превращается в целлобиозу – совместный субстрат (косубстрат) для целлобиозохиноноксидоредуктазы. Этот фермент уменьшает число фенольных радикалов и тем самым ингибирует полимеризацию.

Конденсированные лигнины, содержащие дифенильные связи, проявляют высокую устойчивость к действию ферментов грибов (Chen et al., 1981). В лиственном лигнине и искусственном гваяцил-сирингильном лигнине сирингильные элементы подвергаются деструкции быстрее, чем гваяцильные. Это объясняется большим содержанием в гваяцильной части лигнина дифенильных структур, у которых фенольные гидроксильные группы не склонны к образованию феноксильных радикалов (Фенгел, Вегенер, 1988).

Таким образом, существующие обзоры свидетельствуют о существенной дискуссионности проблемы трофического использования грибами такого нестереорегулярного биополимера как лигнин, однако исследования характера динамики метоксильных групп в питательном субстрате, обогащенном лигнином, при лабораторном культивировании грибов белой гнили, на наш взгляд, способно несколько прояснить этот вопрос.

От химической природы и особенностей используемого источника углерода зависит в основном и доступность для мицелиальной культуры того или иного источника азота. Азотистые соединения, которые являются важнейшей составной частью протоплазмы и играют большую роль в обмене веществ у грибов, являются основой белков (Горленко, 1985). Грибы не в состоянии связывать атмосферный азот, а могут принимать его только в форме неорганических солей или органических азотных соединений (Morton, Mc Millan, 1954). Большинство грибов хорошо усваивает аммиачные соли – сульфат аммония, фосфат аммония, а также аммиак из водного раствора. Соли азотной кислоты не всегда хорошо усваиваются (Беккер, 1988). Только некоторые виды дрожжей испытывают потребность в нитратах. Часто источником азота в состав сред включают мочевину. Также как и в случае с источниками углерода, роль источников азота в процессах роста и метаболизма наилучшим образом изучена и описана вотношении продуцентов антибиотиков. На средах с одними источниками азота организмы могут хорошо развиваться, но не осуществляют в данных условиях биосинтеза антибиотика. Это свидетельствует о наличии регуляторной роли доступности азота для его включения в процессы метаболизма (Егоров, 1986). Обычно в средах для культивирования микроорганизмов в качестве источника азота используют соли азотной (HNO₃), или реже соли азотистой (HNO₂) кислот, аммонийные соли органических или неорганических кислот (-NH₄) или аминокислоты (NH₂), белки и продукты их гидролиза (пептоны, гидролизаты). Как видно, в этих источниках азот находится или в виде окисленной формы (-NO₃, – NO₂), или в восстановленной форме (NH; – NH₂). В натуральных средах неопределенного состава, содержащих соевую муку, кукурузный экстракт и другие подобные компоненты, азот содержится главным образом в форме белков, питательная ценность которых зависит от наличия у микроорганизмов соответствующих протеаз, расщепляющих эти белки, и определяется тем, насколько легко в процессе ферментативного гидролиза из белков освобождается азот в виде аминокислот и несложных полипептидов, а в конечном счете в форме – NH₂. Аминокислоты играют существенную роль в метаболизме микроорганизмов. Это объясняется, во-первых, тем, что аминокислоты непосредственно участвуют в синтезе белка (структурного и ферментов) и различных полипептидов; во-вторых, они могут принимать участие в образовании антибиотиков, в том числе и небелковой природы. Аминокислоты могут оказывать заметное влияние на активность ферментов (индуцировать их образование или репрессировать, подавлять активность). Присутствие в среде одних аминокислот может приводить к образованию других.

Как уже указывалось, доступность того или иного источника азота зависит в основном от химической природы используемого углерода. Использование аммония и некоторых органических источников азота грибами в большой степени зависит от наличия в среде органических кислот. Небольшие количества (0,1 – 0,2 %) дикарбоновых кислот с четырьмя углеродными атомами (например, янтарная, фумаровая) способствуют лучшему усвоению азота. Это, по всей вероятности, связано с тем, что в данном случае легче образуются кетокислоты, которые, как было указано выше, в свою очередь, связывают аммиак. В этом виде значительно упрощается включение аммиака в метаболизм грибов. Определенную роль в развитии организмов и образовании вторичных метаболитов играют также катионы и анионы солей используемых источников азота (Егоров, 1986). Если организм хорошо использует аммонийную форму азота, то для его развития небезразлично, в какой форме этот аммоний вводится в среду. При использовании, например, сернокислого и молочнокислого аммония можно получить различные результаты, несмотря на то, что азот представлен одной и той же формой. При использовании сернокислого аммония среда будет сильно подкисляться в результате накопления ионов серной кислоты. Если же будет использоваться молочнокислый аммоний, то резкого сдвига в значении рН субстрата может не произойти, так как освобождающаяся молочная кислота легко может быть использована организмом в качестве источника углерода. Таким образом, в данном случае роль аниона при одной и той же форме азота будет также различной. Все эти факторы необходимо учитывать при изучении развития микроорганизмов и возможностей образования ими метаболитов.

Для продуцентов антибиотиков указывается, что в зависимости от источника азота и формы, в которой он присутствует в среде, микроорганизм будет в состоянии синтезировать антибиотическое вещество или он будет лишен этой способности (Егоров, 1986). Так, продуцент стрептомицина не образует антибиотика при развитии на средах с нитратами или нитритами в тех случаях, когда они являются единственными источниками азота. Образование стрептомицина происходит на средах с аммонийными источниками азота. Биосинтез пенициллина идет более энергично, если в среде наряду с аммонийным источником азота имеется нитратный источник азота.

Роль особенностей и степени доступности различных источников азота активно изучалась и в отношении высших базидиальных грибов, в том числе, древоразрушающих. Выбор источника азота очень важен для получения хорошего роста мицелия в культуре и высокого содержания в нем протеина (Бухало, 1988). Факт того, что потребность грибов в азоте в значительной мере зависит от снабжения их углеродом, а также от других факторов обсуждается и в отношении базидиомицетов (Маслова, 1969; Биосинтетическая деятельность… 1969; Berry, 1975; Dijkstra, 1976). Высшие базидиомицеты могут использовать как неорганические, так и органические формы азота. Основными источниками неорганического азота являются аммонийные соли и нитраты. По мнению некоторых исследователей (Биосинтетическая деятельность … 1969; Маслова, 1969; Treschow, 1944; Вегту, 1975; Dijkstra, 1976), нитраты не усваиваются или плохо усваиваются многими высшими базидиомицетами. Имеются, однако, сведения, что некоторые виды родов Tricholoma, Coprinus, Collybia, Lentinus хорошо используют нитраты (Маслова, 1969; Бухало и др., 1972; Rawald, 1963).

Органический азот обычно обеспечивает лучший рост мицелия, чем минеральные соли азота (Биосинтетическая деятельность…1969; Маслова, 1969; Dijkstra, 1976). Из органических источников азота для выращивания мицелия съедобных грибов используются мочевина и аминокислоты. Как один из благоприятных источников азота отмечается аспарагин (Berry, 1975). Хорошими источниками азота для высших базидиомицетов являются белки, пептоны, свободные аминокислоты, гидролизат казеина. При исследовании физиологии грибов рода Coprinus (Fries, 1955) показано, что у них существуют видовые и штаммовые различия усвоения разных форм азота. Одни штаммы Coprinus fimetarius способны усваивать нитраты, другие – нитриты. Азотное питание у многих видов высших съедобных базидиомицетов до настоящего времени не изучалось.

В качестве источника азота на синтетической среде с глюкозой А.С. Бухало с сотрудниками испытаны нитратные и аммонийные соли (NaNO₃, NH₄C1, NH₄NO₃), а для некоторых видов – также органические соединения азота: аспарагин, мочевина и пептон (Бухало, 1988). Контролем служил рост мицелия на среде с NaNO₃. Не все испытанные виды росли на среде с нитратным азотом. Его не усваивают Agaricus bisporus, Lepista nuda, Flammulina velutipes, слабо утилизируют NaNO₃ Pleurotus ostreatus, Рanus tigrinus. В то же время, Agaricus hortensis, Armillariella jnellea, Macrolepiota procera, Marasmius scorodonius, Lycoperdon pyriforme и Coprinus micaceus лучше росли на среде с нитратным азотом, чем с аммонийным. На средах с аммонийными источниками азота лучше, чем на среде с нитратным азотом, развивались Schizophyllum commune, Sparassis rispa, Pleurotus ostreatus, Panus tigrinus, P. conchatus, Oudemansiella radicata, Agaricus arvensis, A. silvaticus, Coprinus comatus, Scleroderma citrinus, Suillus variegatus и др. Наилучший рост испытанных штаммов, кроме Macrolepiota procera и Pleurotus ostreatus, отмечен на среде с органическим источником азота – аспарагином. На среде с мочевиной в указанных исследованиях прекрасно развивались культуры Pleurotus ostreatus, Kuehneromytes mutabilis и Agaricus arvensis, но слабо росли Macrolepiota procera, Agaricus bisporus, Flammulina velutipes и др. Установлено, что на среде с NaNO₃ и аспарагином большинство испытанных штаммов незначительно изменяют рН среды в кислую сторону. При культивировании на среде с аммонийными соединениями азота, являющимися в данном случае солями сильных кислот, 40-50 % испытанных грибов подкисляют питательную среду до рН 3-4. А.С. Бухало (1988) отмечает, что аммонийные соли являются хорошим источником азота для культивирования высших базидиомицетов. Однако в связи с тем, что на синтетической среде с аммонийными солями происходит закисление питательной среды, культивирование следует проводить, используя аммонийные соли слабых кислот. Проведенные исследования, безусловно, имеют огромное теоретическое и прикладное значение, однако в анализе полученных данных авторами практически не уделяется внимания взаимосвязи между особенностями ассимиляции азота и трофической принадлежностью вида. Однако, на наш взгляд, это перспективная сфера исследований, которая приобретает особое значение в применении к биотехнологически ценным культурам, поскольку от источника азота могут зависеть не только ростовые, но и продуктивные показатели. Более того, заслуживает внимания такое направление, как возможности регуляции темпов развития, стимуляции или пассивации метаболических процессов модификацией видов источников азота, дробности их внесения в субстрат и т.п. При направленном биосинтезе, например, целлюлолитических ферментов грибом Peniophora gigantea наивысшая биохимическая активность клеток наблюдается на средах с органическим азотом (аспарагин, пептон и др.) (Мосин, 2002).

Питательные резервы мицелия имеют большое значение для последующего плодоношения (Robert, 1977, 1979; Morimoto et al., 1981). При использовании традиционных методов культивирования вегетативная и репродуктивная фазы развития грибов проходят на едином субстрате. В методах японских авторов (Oyama et al., 1974) вегетативная и репродуктивная фазы обеспечиваются оптимальными условиями питания на разных средах. Причем после появления зачатков плодовых тел все используемые соединения азота поступают из мицелия. Плодовые тела таких видов, как Flammulina velutipes, Panus tigrius, Pleurotus ostreatus и других, легко плодоносящих в культуре, образуются на том же субстрате, на котором сохраняется в лаборатории культура гриба.

В качестве питательных субстратов для получения плодовых тел в лабораторных исследованиях используют пористые материалы, например, смоченные разбавленным пивным суслом или минеральной средой древесные опилки и древесную муку, мелко нарезанные веточки и хвою, высушенный ржаной хлеб с водой, кашицу из хлебных крошек, размягченную в 40 %-ном растворе лимонной кислоты. Многие исследователи занимались разработкой питательных сред для получения плодоношений отдельных видов высших базидиомицетов: Flammulina velutipes Lentinus edodes, Panus tigrinus, Pleurotus ostreatus и др. (Plunkett, 1953; Leatham, 1983). Однако трудно судить, оптимальны ли предложенные среды, так как отсутствуют качественные и количественные данные о продуктивности плодоношения грибов на этих средах.

Плодоношение можно получить как на твердых, так и на жидких средах в поверхностной культуре, но на жидкой среде плодовые тела обычно появляются позднее (Бухало, 1988).

Состав питательной среды является одним из определяющих факторов, влияющих на плодоношение высших базидиомицетов в условиях чистой культуры (Бухало, 1988). Изучение влияния компонентов питательной среды на плодоношение, проведенное на синтетических средах рядом исследователей, позволило сделать определенные выводы, суммированные Ф. Орриер (Horriere, 1979). Для получения плодоношения в чистой культуре питательные среды должны соответствовать определенным требованиям. Источник углерода в наиболее часто используемых для плодоношения средах вносится в виде углеводов (глюкозы, мальтозы, сахарозы, спирта). У некоторых видов, особенно древоразрушающих грибов, добавление в питательную среду фильтровальной бумаги или соломы стимулирует плодоношение. Азот в такие среды вносится в органической (в виде аланина, аспарагина, других аминокислот) или минеральной форме. В последнем случае предпочтение отдается аммонийным солям.

Большое значение для развития организмов и образования ими метаболитов имеет количественное соотношение источников углерода и азота, содержащихся в среде. Известно, что для наиболее благоприятного роста мицелия в среде должно существовать определенное соотношение между углеродом и азотом, что составляет примерно 20:1 (С: N = 20) (Беккер, 1988). Однако такое соотношение углерода и азота не всегда благоприятно для образования метаболитов. Например, далеко не во всех случаях биосинтез антибиотика происходит пропорционально накоплению биомассы микроба-продуцента (Мосин, 2002). Зачастую при хорошем росте организма не наблюдается образования антибиотика или он синтезируется в небольшом количестве. Поэтому при культивировании штамма с целью образования им веществметаболитов необходимо в каждом конкретном случае подбирать соответствующие соотношения углерода и азота в среде. В питательной среде, предназначенной для получения стадии телеоморфы у базидиальных грибов также большое значение имеет отношение С: N. При его очень высоких показателях плодоношение обычно отсутствует, а при очень низких – образуется много зачатков, но плодовые тела не развиваются (Plunkett, 1953; Sugimori et al., 1971; Horriere, 1979; Бухало, 1988). Оптимальное значение отношения С: N в этом случае приближается к 30, оно зависит от состава среды (Horriere, 1979), некоторое увеличение в которой азота и уменьшение углерода ускоряют появление плодоношения.

По сведениям З.Э. Беккер, приблизительно 17 – 18 минеральных элементов необходимы для основного обмена грибов. В их число входят макро- и микроэлементы, такие как сера, фосфор, калий, железо, медь, цинк, марганец, молибден, кальций. В этих же работах указывается возможность потребности в кобальте, галлии, боре, скандии, ванадии (Беккер, 1963; Беккер, 1988).

Достоверно выявлено, что изменение компонентов питательной среды сказывается на накоплении минеральных веществ в мицелии. Так, количество золы в мицелии трутовика Fomes marginatus оказалось очень большим при выращивании его на неразбавленной среде Варена (Рипачек, 1967). Количество минеральной золы, встречающееся у грибов, колеблется в пределах от 6 до 12 % от массы сухого мицелия. В их зольном составе обычно преобладают фосфор и калий, меньше магния и железа. Так как потребность в минеральных компонентах питательной cреды складывается на основе преобладающих у данного вида путей метаболизма, состав основных компонентов золы может варьировать. Так, у дрожжей с преобладанием гликолитического пути обмена, связанного с переработкой углеводов через путь спиртового брожения, при слабом размножении клеток в составе золы обнаружено до 50 % фосфора, который особенно необходим для этих процессов, и 25 % калия. Однако у малоспособных к спиртовому брожению, но сильно разрастающихся гифообразных грибов наблюдается в золе обратное соотношение (Беккер, 1988). В остальных 25 % от состава золы грибов в обоих случаях можно обнаружить до 50 различных элементов, обычно встречающихся в почве: марганец, железо, магний, цинк, медь, кальций (Добровольский, 2004). Фосфор, калий и сера составляют контингент самых важных неорганических компонентов обмена.

Данные о роли многих микроэлементов в процессах роста и метаболизма культур микроорганизмов представлены, в большинстве своем, общими сведениями. Обзор роли железа, магния, кальция, калия, а также целого ряда прочих микроэлементов свидетельствует, что исследования в этой области, касались, в основном, продуцентов антибиотиков. Микроэлементы Cu, Zn, Mn, Мо, Со также играют существенную роль в жизнедеятельности микроорганизмов, причем роль этих элементов в клеточном метаболизме ксилотрофных базидиомицетов велика и в достаточной степени изучена.

Названные элементы обладают высокой каталитической активностью в процессах внутриклеточного обмена. Их каталитическая активность возрастает в тысячи и миллионы раз в тех случаях, когда ионы металлов соединятся с молекулами органических веществ и образуют так называемые органоминеральные комплексы. Эти внутрикомплексные металлорганические соединения (хелаты) играют важную роль в реакциях фермент – субстрат.

Медь в сочетании со специфическими белками образует ряд ферментных систем. Представителями этой группы ферментов являются полифенолоксидазы и аскарбиноксидазы, нитратредуктаза, альдегидоксидаза и др. Особую значимость медь имеет для ксилотрофных безидиомицетов – грибов белой гнили, поскольку ионы меди входят в состав активных центров «голубых» оксидаз. В активный центр лакказ входят четыре иона меди, координированное взаимодействие которых приводит к сопряжению процесса одноэлектронного окисления субстратов – доноров с четырехэлектронной реакцией восстановления дикислорода (Горбачева и др., 2008). Установлено, что глубинная биомасса высших базидиальных грибов обладает значительным потенциалом для связывания ионов меди (Ровбель и др., 2004). Изучено влияние различных концентраций меди на накопление биомассы и синтез липидов у Pleurotus ostreatus. Добавление в среду ионов меди в низких концентрациях (1 мМ) способствовало, на фоне некоторого угнетения роста, интенсивному накоплению общих липидов, тогда как повышенное содержание элемента (5 мМ) приводило к резкому снижению обоих показателей (Николайчук и др., 2005). Различное действие низкой и высокой концентраций ионов меди на накопление общих липидов в мицелии может быть обусловлено разной степенью ингибирования (или активирования) ионами меди ферментов, участвующих в синтезе липидов, а также изменением структуры мембран клеток (Демидчик и др., 2001).

Марганец входит в состав многих ферментных систем ксилотрофных базидиомицетов и, в первую очередь, в состав карбоксилаз. Он принимает, по-видимому, участие в синтезе протеиназ. Марганец входит также в состав фосфорилаз, которые участвуют в переносе фосфорной кислоты от аденозинтрифосфата. Фермент Mn-зависимая пероксидаза был выделен наряду с лигниназой из культуральной жидкости гриба Phanerochaete chrisosporium (Kuwahara et al., 1984). Установлено, что фермент содержит гем и окисляет фенольные соединения в присутствии перекиси водорода. Однако из пероксидаз этот фермент отличается тем, что для проявления его активности необходимо присутствие в среде марганца (Harvey et al., 2001). Данный фермент способен регенерировать пероксид водорода, используя в качестве доноров протонов восстановленные глутатион и NADH (Asada et al., 1995). Обнаружено позитивное влияние ионов марганца на темпы формирования такой маркерной морфологической структуры как коричневая пленка у Lentinus edodes (Цивилева и др., 2006).

В целом, обзор данных о роли микроэлементов в процессах роста и метаболизма базидиомицетов, свидетельствует о том, что конкретная информация однобока и несколько ограничена. Указывается, что недостатком в среде минеральных элементов, в частности фосфатных и сульфатных ионов, К, Mg, ряда других микроэлементов (железа, цинка, марганца, меди, бора и молибдена) часто ингибируется плодоношение макромицетов в культуре. (Бухало, 1988). Определенный интерес, на наш взгляд, представляет исследование роли, в частности, в развитии культур древоразрушающих базидиомицетов, ряда эссенциальных элементов, таких как селен, германий. Факт повышенного содержания селена в плодовых телах базидиомицетов установлен и описан в литературе (Ермаков, Ковальский, 1979; Блинохватов, 1995). Наши исследования, проведенные в 19962002 гг. обнаружили интересные зависимости в реакциях на внесение соединений селена в питательные среды у быстро и медленнорастущих культур базидиомицетов (Денисова (Ильина), 1999; Блинохватов и др., 2000; Иванов и др., 2000; Ильина, Сашенкова, 2002).

Повышенное содержание германия и активное накопление названного элемента базидиомами и мицелием грибов рода Ganoderma активно обсуждается в последние годы (Song et al., 2003). Факт повышенного, по сравнению с растительными и животными организмами (в среднем, в 50-100 раз) накопления германия грибами, а именно ксилотрофными базидиомицетами, описан в работах отечественных ученых (Воронков, Мирсков, 1982).

Микроорганизмы, как и прочие организмы, нуждаются в оптимизирующих развитие факторах, они позитивно реагируют на присутствие в питательной среде витаминов, аминокислот, цитокининов и других биологически активных веществ. Для многих базидиальных макромицетов в культуре рекомендуется внесение комплекса аминокислот и тиамина хлорида, предложена среда для базидиомицетов следующего состава (г/л): D-Glc – 10; L-Asn – 1; KH₂PO₄ – 5; MgSO₄.7H₂O – 2.5; FeSO₄.7H₂O – 0.03; тиамин – 5.10^-4; H₂O до общего объема 1 л (Song et al., 1987, цит. по Цивилева, 2008). Именно высшие базидиомицеты характеризуются выраженной гетеротрофностью в отношении тиамина, что выделяет их среди грибов других систематических групп. Потребность в этом витамине была установлена у многих видов съедобных грибов, относящихся к родам Boletus, Suillus, Paxillus, Pleurotus, Panus, Lentinus, Tricholoma, Flammulina, Collybia, Agaricus, Russula, Lepiota, Coprinus, Clitocybe, Mycena, Pholiota, Lactarius, Stropharia и др. В то же время потребность в тиамине у высших баэидиомицетов не является абсолютной. Например, выявлены штаммы видов Agaricus bisporus, Pleurotus ostreatus, некоторых видов рода Marasmius, автотрофные в отношении тиамина (Биосинтетическая деятельность… 1969).

А.С. Бухало с сотрудниками исследовано влияние на рост высших базидиомицетов тиамина, отваров растений, дрожжевого автолизата, других субстратов, содержащих витамины (Бухало, 1988). При этом было установлено, что на синтетической среде с тиамином больше биомассы, чем в контроле, образуют Panus conchatus, Armillariella mellea, Coprinus comatus и Macrolepiota procera, отдельные штаммы Pleurotus ostreatus и Flammulina velutipes. Стимулирующее действие на рост Fistulina hepatica, Pleurotus ostreatus, Armillariella mellea, Kuehneromyces mutabilis, Macrolepiota procera, Panus tigrinus, Flammulina velutipes и другие виды оказывают отвары крапивы и дубовой коры, дрожжевой автолизат. В качестве стимуляторов на синтетической среде с сахарозой испытаны отвары зеленой массы различных сельскохозяйственных культур. На всех средах с растительными стимуляторами, по сравнению с контролем, Fistulina hepatica, Panus conchatus, Armillariella mellea, Kuehneromyces mutabilis отдельные штаммы Pleurotus ostreatus, Flammulina velutipes и другие виды увеличивают продукцию биомассы. Эти культуры слабо растут на контрольной синтетической среде. Показана целесообразность использования естественных органических субстратов, содержащих витамины и другие стимуляторы, в качестве компонентов питательных сред для улучшения роста и увеличения продукции биомассы мицелия при культивировании высших съедобных базидиомицетов.

С наступлением эры антибиотиков, а позже – биологически активных добавок и в связи с широким применением микроорганизмов в разных отраслях промышленности остро встал вопрос об экономически оправданных, сбалансированных по составу питательных средах. Эффективной добавкой оказался, благодаря наличию в нем витаминов, аминокислот и минеральных элементов в легко ассимилируемых формах, кукурузный экстракт (Мосин, 2002). Кроме кукурузного экстракта в рецептуры сред включают дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт, гидролизат дрожжей, клеточный сок картофельных клубней, молочную сыворотку, экстракт пшеничных отрубей, экстракт солодовых ростков и другие продукты. В целях снижения затрат на ингредиенты для питательных сред в настоящее время широко используются отходы сельского хозяйства и перерабатывающей промышленности (Обрезкова и др, 2010). Например, предложено в качестве источника углерода, азота, фосфора, микроэлементов, а также индуктора ферментов использовать прогидролизованный ячменный солод; в качестве стимуляторов роста и биосинтеза ферментов – прогидролизованные солодовые ростки; в качестве индуктора пектолитических ферментов – прогидролизованный свекловичный жом (Салманова, Соболевская, 1994).

В последние десятилетия как быстрый и эффективный метод производства посевного материала для грибоводства предлагается также глубинное культивирование (Yang, Jong, 1989). Очень небольшое число работ посвящено биохимии глубинного культивирования, ее связи с физиологией роста и развития грибного организма в глубинной культуре. Необходимым условием роста и развития мицелия базидиальнх макромицетов в глубинных условиях является достаточное количество кислорода. Потребность аэробных микроорганизмов в молекулярном кислороде зависит от источника окисляемого источника углерода и от физиологических свойств и активности роста микроорганизмов. Растворимость кислорода в среде сравнительно низка и зависит от температуры, давления и от концентрации растворенных, эмульгированных и диспергированных компонентов. При давлении 0,1 МПа (1 кгс/см²) и температуре 30 °C в 1 л дистиллированной воды максимальное количество растворенного кислорода составляет 7,5 мг. В реальной питательной среде максимальная растворимость кислорода 2 – 5 мг/л. Запасы кислорода в среде обеспечивают жизнедеятельность аэробного продуцента в течение 0,5 – 2 мин (Мосин, 2002). При глубинном культивировании запасы кислорода в питательной среде возобновляются при подаче аэрирующего воздуха. Скорость адсорбции кислорода увеличивается с ростом интенсивности перемешивания среды. Установлено, что во время роста биомассы микроорганизмы обычно потребляют больше кислорода, чем во время сверхсинтеза целевого метаболита.

Реакция погруженных культур ряда видов ксилотрофных базидиомицетов на изменение содержания кислорода в среде описана нами (Ильина, 2008).

Значительная часть сред, рекомендованных для выделения культур грибов, содержит селективные компоненты. Для подавления роста бактерий нередко добавляют противобактериальные антибиотики или снижают рН среды. С целью подавления роста грибов, сопутствующих выделяемому виду, кроме противогрибных антибиотиков используют и другие фунгицидные препараты – бычью желчь, кристалл-виолет, пропионат кальция и др. Широко используемой средой для выделения и культивирования как сапрофитных, так и прочих грибов, является декстрозный агар Сабуро, содержащий (г/л): глюкозу 40,0 г; пептон 10,0 г; агарагар 20,0 г при рН 5,6±0,2. Благодаря низкому значению рН, рост бактерий на этой среде подавляется. Однако наибольшее распространение нашли среды, представляющие собой модификации оригинальной среды Сабуро, придающие ей дифференциальнодиагностические свойства. Известной модификацией, используемой в свою очередь в составе других сред, является модификация Эммонса, отличающаяся от оригинальной среды тем, что содержит только 2 % глюкозы, вместо 4 %, и рН на уровне нейтрального – 6,9–7,0. Добавлением к среде такого состава антимикробных препаратов в различных комбинациях, включающих циклогексимид, хлорамфеникол, гентамицин, ципрофлоксацин, пенициллин или стрептомицин для ингибирования роста некоторых грибов и бактерий, достигается ее селективность. Aгар Сабуро в модификации Эммонса с добавлением хлорамфеникола (50 мг/л) и циклогексимида (500 мг/л) является селективным и используется для выделения патогенных грибов из биообразцов, высококонтаминированных сапрофитными грибами и бактериями. Эта среда встречается под коммерческими названиями Mycobiotic agar (Difco), Mycosel agar (BBL).

Признанной микологами – практиками особенностью большинства видов ксилотрофных базидиомицетов является такая их характеристика, как хороший рост в культуре. По сравнению со многими другими представителями грибов, эта группа представлена, в большинстве своем, факультативно-сапротрофными видами, чьи трофические потребности относительно легко удовлетворяются в условиях лабораторного культивирования. Однако, проблемы оптимизации выделения, хранения, поддержания стабильности штаммов остаются весьма актуальными. Разработка новых, адаптированных с учетом узкой трофической специализации, происхождения, возраста сохраняемой культуры, приемов представляется перспективным направлением исследований.

1.3 Ксилотрофные базидиомицеты как перспективный объект биотехнологии

Искусственное выращивание грибов способно внести существенный вклад в дело обеспечения продовольствием возрастающего населения земного шара. Грибы употребляют в пищу с глубокой древности, поэтому сделать грибы такой же управляемой сельскохозяйственной культурой, как зерновые злаки, овощи, фрукты, давно уже стало актуальной задачей. Наиболее легко поддаются искусственному выращиванию дереворазрушающие грибы. Это связано с особенностями их биологии, их способность легко расти и плодоносить использовали с древнейших времен.

Искусственное разведение дереворазрушающих грибов получило довольно широкое распространение. Мицелий съедобных грибов, как и мицелий продуцентов антибиотиков можно выращивать на жидких средах, в глубинной культуре. Зачастую это полностью механизированный и автоматизированный процесс. Так, в Институте микробиологии Академии наук Белоруси (1990) разработаны и апробированы в опытном производстве способы получения белковых грибных препаратов даедалина и пантегрина из мицелия дереворазрушающих грибов дедалеопсиса бугристого (Daedaleopsis сonfragosa) и пилолистника тигрового (Panus tigrinus), с высоким содержанием белка и биологически активных веществ. По содержанию белка 1 кг этих препаратов эквивалентен 2 кг мяса. По биологической ценности белок этих препаратов не уступает растительным и приближается к животным белкам. Перевариваемость белков данных препаратов составляет свыше 80 %. В основе этого способа получения пищевого белка лежат полученные микологами данные о том, что плодовые тела грибов и их мицелиальная масса близки по своему химическому составу и пищевой ценности. Исследования в этом направлении продолжаются (Бабицкая и др., 2006).

Ксилотрофные базидиомицеты обладают богатыми комплексами целлюлозо- и лигнолитических ферментов. Целлюлозолитические ферменты очень специфичны, их действие проявляется в деполимеризации молекул целлюлозы. Обычно используются в виде комплекса, доводящего гидролиз целлюлозы до глюкозы (в гидролизной промышленности). В медицинской промышленности их используют для выделения стероидов из растений, в пищевой – для улучшения качества растительных масел, в сельском хозяйстве – как добавки в комбикорма для жвачных животных.

Базидиальные грибы, возбудители белой гнили, синтезируют мультиферментный комплекс лигнолитического действия, принимающий участие в процессе деградации лигнина (Клесов, 1985; Рабинович, 2000; Клечак и др., 1999, 2010; Титова и др., 2002; Русинова, 2009; Рагимова, 2010). Неспецифичность ферментов лигнолитического действия и их высокая окислительная способность открывают широкие возможности для использования как самих грибов лигнинолитиков, так и их лигнинолитических ферментов в системах детоксификации и деградации ксенобиотиков, биоремедиации почв и вод (Королева, 2006). Разработка экологически чистых биотехнологий как для обработки и модификации лигнинсодержащих материалов, так и для утилизации лигнинсодержащих отходов (в особенности для целлюлознобумажной и текстильной промышленности), интенсифицировала изучение механизма деградации лигнина базидиальными грибами и роли их лигнинолитических ферментов в этом процессе (Такташев, 2002; Бойко и др., 2008; Древаль, Бойко, 2009).

В работе Г.П. Александровой и С.А. Медведевой изучена лигниндеструктирующая способность базидиального гриба Daedaleopsis сonfragosa (1999). Показана перспективная возможность использования комплекса оксидазных и ксиланазных ферментов, продуцируемых грибом, для деструкции и снижения содержания остаточного лигнина сульфатных целлюлоз.

В настоящее время активизировались исследования ферментативной активности отдельных видов ксилотрофных базидиомицетов, результаты которых находят широкое практическое применение. В работе О.Н.Горбатовой и др. (2006), в результате целенаправленного скрининга по лигниндеструктирующей способности (индексу ксилолиза), в качестве объекта исследований был выбран гриб Daedaleopsis сonfragosa. За относительно короткий срок инкубирования (14 сут) при небольшой потере массы древесины (ПМД) (5 %) и целлюлозы (всего 0.9 %), потери лигнина, вызванные действием Daedaleopsis сonfragosa, составляли 23 %. Эти показатели деятельности гриба, с точки зрения эффективности и избирательности делигнификации, несколько лучше, чем для Phanerochaete sanguinea, одного из наиболее известных (Lakshminarayana et al., 1992) лигнинолитических грибов. Биоотбелка сульфатных целлюлоз может осуществляться ферментами, прежде всего, оксидазного типа за счет окислительной деструкции лигнина, что приводит к его функционализации и способствует увеличению растворимости. Среди лигнинразрушающих ферментов известны лигнинпероксидаза и лакказа, которые осуществляют одноэлектронный перенос с молекулы субстрата лигнина – и тем самым катализируют широкую серию далее протекающих с ним реакций. Кроме того, гемицеллюлазные ферменты способны гидролизовать гемицеллюлозы, переосажденные на поверхности целлюлозного волокна, облегчая последующую экстракцию лигнина (Ахмедова, 1992; Дудкин и др., 1991; Ежов и др., 1993). Среди внеклеточных ферментов, продуцируемых Daedaleopsis сonfragosa, выявили наличие лигнинпероксидазной, лакказной, ксиланазной и целлюлазной активностей (Горбатова и др., 2005). Максимальная активность перечисленных ферментов отмечена у гриба на 7 сутки культивирования. Активность лигнинпероксидазы оказалась доминирующей, а целлюлазы – минимальной. Такое сочетание ферментативной активности позволяет считать Daedaleopsis сonfragosa перспективной культурой для использования в процессах отбелки. Обработку небеленой сульфатной хвойной целлюлозы в указанной работе осуществляли семидневной культурой Daedaleopsis сonfragosa и проследили влияние продолжительности обработки на состав сульфатцеллюлозной массы в сравнении с Phanerochae tesanguinea.

Конец ознакомительного фрагмента.