Глава 3. Цитогенетика
Наука не является и никогда не будет являться законченной книгой.
Цитогенетика – это раздел генетики, изучающий структурно-функциональную организацию генетического материала на уровне клетки, главным образом хромосом (Смирнов В. Н., 1990). Для всестороннего понимания организации генетического материала высших организмов (в том числе и человека) необходимы знания общих закономерностей упаковки ДНК во всех вариантах, предоставленных живой природой, – геномах вирусов, прокариот, протистов, клеточных органоидов.
3.1. Генетический материал вирусов и прокариот
Генетический материал вирусов представлен одной молекулой нуклеиновой кислоты (либо ДНК, либо РНК), окруженной защитной белковой оболочкой – капсидом. Функционирование вирусов происходит по-разному, в зависимости от их свойств и структуры, но всегда с помощью ферментативной системы клетки-хозяина. Вирусы могут существовать только как внутриклеточные паразиты. До сих пор не закончен давний научный спор, можно ли считать вирус живым: «существо или вещество».
Существуют вирусы, имеющие одно– и двухцепочечные РНК, и вирусы, имеющие одно– и двухцепочечные ДНК, причем обе группы ДНК-содержащих вирусов имеют представителей с линейными и кольцевыми формами. У аденовирусов двухцепочечная ДНК связана с терминальным белком, а у вируса оспы ДНК замкнута на концах ковалентной связью (Льюин Б., 1987).
РНК-содержащие вирусы более разнообразны. Так, выделяют вирусы с «плюс-цепью», которые сразу могут функционировать, и вирусыс «минус-цепью», которые вначале должны построить «плюс-цепь» с помощью РНК-полимеразы клетки-хозяина. Двухцепочечные вирусы представляют собой варианты соединенных цепей без расхождения после синтеза второй цепи. Особую группу РНК-содержащих вирусов составляют ретровирусы, которые будут рассмотрены ниже. Размеры РНК-содержащих вирусов обычно варьируют в пределах 3000–7000 нуклеотидов, а самый маленький из них имеет всего 1200 рибонуклеотидов и 1 структурный ген, кодирующий белок оболочки капсида.
ДНК-содержащие вирусы, особенно фаги (вирусы бактерий), обычно значительно крупнее РНК-содержащих. Так ДНК фага Т4 содержит 180 000 п. н. и кодирует множество белков. Крупные молекулы ДНК вирусов компактно упакованы внутри капсида благодаря суперспирализации.
Возможны два варианта развития вируса в клетке: либо интеграция с геномом хозяина – лизогения, либо синтез вирусных частиц на основе генетической программы вируса, но с помощью метаболической системы хозяина – лизис. Второй вариант обычно приводит к разрушению клетки-хозяина. Факт регуляции генной активности вируса, его способности существовать в интегрированной форме, был доказан в работах нобелевского лауреата 1965 г., французского микробиолога А. Львова (1902–1994). Интегрированная форма вируса получила название профаг. Под действием внешних факторов (например, УФ-облучение) возможна активация профага и вновь превращение его в фаг.
Вирусы обычно обладают специфичностью в отношении клеток организма хозяина.
Геном прокариот представлен одной кольцевой молекулой ДНК, формирующей компактную структуру нуклеоида посредством суперспирализации. Весьма хорошо изучен геном кишечной палочки (Escherichia coli) – классического генетического объекта, у которой идентифицировано более 4200 генов. ДНК E. coli содержит 4,6 млн п. н. Наименьший размер генетического материала у живых организмов (не будем относить к ним вирусы) отмечен у микоплазмы: 600 000 п. н. и около 500 генов. Эти данные и послужили основой для теоретических расчетов, которые показали, что элементарная «машина жизни» может работать при наличии всего 350 генов.
Главная особенность организации генома прокариот – это их объединение в группы, или кластеры, с общей регуляцией. Группа структурных генов прокариот, находящихся под контролем одного регуляторного участка, называется опероном (Miller J., Reznikoff W., 1978). Организация генетического материала по типу оперона позволяет бактериям быстро переключать метаболизм с одного субстрата на другой. Бактерии не синтезируют ферменты определенного метаболического пути в отсутствие необходимого субстрата, но способны в любой момент начать их синтез при появлении этого субстрата. Структура и функционирование оперона были показаны в работах знаменитых французских биохимиков Ж. Моно (1910–1976) и Ф. Жакоба, разделивших с А. Львовым Нобелевскую премию 1965 г. Регуляцию по типу оперона мы рассмотрим ниже.
Особый интерес представляют плазмиды – небольшие кольцевые молекулы ДНК внутри бактериальной клетки. Подобно вирусам, плазмиды способны либо интегрироваться с бактериальной ДНК, либо существовать обособленно от нее. Крупные плазмиды присутствуют в клетке в количестве 1–3 копий, мелкие могут быть представлены десятками копий. Хорошо изучена самая первая из обнаруженных плазмид, крупная плазмида F бактерии E. coli. Она представляет собой кольцевую молекулу ДНК величиной в 100 тыс. п. н. и содержит более 60 генов. Плазмида F обеспечивает содержащим ее бактериальным клеткам возможность взаимодействовать с бесплазмидными бактериями и передавать им свою генетическую информацию.
Многие авторы считают, что плазмиды являются одной из разновидностей вирусов и между ними нет принципиальных различий (Жданов В. М., 1988; Кусакин О. Г., Дроздов А. Л., 1994).
3.2. Генетический материал эукариот
Генетический материал эукариот сконцентрирован в ядре и представлен хромосомами, в которых молекула ДНК образует сложный комплекс с различными белками.
Каждая клетка любого организма содержит определенный набор хромосом. Совокупность хромосом клетки называется кариотипом (рис. 3.1). Количество хромосом в клетке не зависит от уровня организации живых организмов – некоторые протисты имеют их более тысячи. У человека в кариотипе 46 хромосом, у шимпанзе – 48, у крысы – 42, у собаки – 78, у коровы – 60, у дрозофилы – 8, у тутового шелкопряда – 56, у картофеля – 48, у рака-отшельника – 254 и т. д.
В кариотипе соматических клеток выделяются пары одинаковых (по форме и генному составу) хромосом – так называемые гомологичные хромосомы (1-я – материнская, 2-я – отцовская). Набор хромосом, содержащий пары гомологов, называется диплоидным (обозначается 2n). Половые клетки – гаметы, содержат половину диплоидного набора, по одной хромосоме из каждой пары гомологов. Такой набор называется гаплоидным (обозначается n).
Рис. 3.1. Кариотип человека
Исследуется кариотип обычно на стадии метафазы митоза, когда каждая хромосома состоит из двух идентичных хроматид и максимально спирализована. Соединяются хроматиды в области центромеры (первичной перетяжки). В этой области при делении клетки на каждой сестринской хроматиде образуется фибриллярное тельце – кинетохор, к которому присоединяются нити веретена деления.
Концевые участки хромосом получили название теломеры. Они препятствуют слипанию хромосом, т. е. ответственны за их «индивидуальность». Теломеры имеют специфический состав ДНК, связанной со специфическим комплексом белков. Состав теломерной ДНК весьма «консервативен» у разных видов. В последние годы теломеры привлекают к себе внимание в связи с проблемой старения клеток и долголетия. Дело в том, что у взрослого организма с каждым новым делением клетки теряется участок теломеры. Потеря всей теломеры приводит к смерти клетки. Понимание генетического контроля этого явления поможет решить многие проблемы медицины.
Участок хроматиды между центромерой и теломерой называется плечом. Плечи имеют свои обозначения: короткое – р и длинное – q. В зависимости от расположения центромеры различают следующие морфологические типы хромосом:
– метацентрические (p = q);
– субметацентрические (q > p);
– акроцентрические (одноплечие – q).
Такое морфологическое разнообразие характерно для большинства организмов. К нему добавляется разнообразие хромосом по размерам. Не совсем понятен биологический смысл этого явления. Известно, что хромосомы – это не просто «кладовые» генетической информации, а активно функционирующие структуры. Их основная биологическая роль заключается в обеспечении равномерности распределения генетического материала при делении клетки и рекомбинации при мейозе. Возможно, морфологическое разнообразие способствует более успешному выполнению этой роли (Гринев В. В., 2006). Хотя можно отметить, что у одних животных хромосомы морфологически удивительно однообразны, хотя и различаются по размерам (лошадь, корова), у других – разнообразны(человек).
Некоторые хромосомы кариотипа имеют вторичную перетяжку, где обычно располагается ядрышковый организатор – область формирования ядрышка. В ядрышке происходит синтез р-РНК и образование субъединиц рибосом. В ядрах разных организмов количество ядрышек варьирует, у некоторых их нет совсем. Часто несколько ядрышковых организаторов участвуют в формировании одного ядрышка.
Для цитогенетического анализа все хромосомы, входящие в кариотип, должны быть идентифицированы. Основной метод идентификации хромосом на цитологических препаратах – это различные способы дифференциальной окраски (Q-, G-, R-, C– и др.), которые базируются на применении определенных красителей, специфически связывающихся с участками ДНК разного строения. Методы дифференциальной окраски, разработанные в конце 1960 – начале 1970-х гг., открыли новую страницу в цитогенетике (Захаров А. Ф., 1977). Каждая дифференциально окрашенная хромосома имеет специфический рисунок исчерченности, что позволяет ее идентифицировать. Интересно, что механизм дифференциальной окраски до сих пор не раскрыт.
Кариотип в цитогенетике принято представлять в виде схемы, в которой хромосомы располагают в определенном порядке, по группам, объединяющим хромосомы одного морфологического типа. Внутри группы хромосомы обычно располагают по размеру в убывающем порядке. Такая схема называется идиограммой. Каждая хромосома идиограммы имеет свой постоянный номер. Гомологичные хромосомы имеют одинаковый номер, но изображается на идиограмме только одна их них.
Кариотипы наиболее важных генетических объектов, таких как человек, лабораторные и сельскохозяйственные животные, стандартизированы (Paris Conference, 1971; Reading Conference, 1976). Стандарты предполагают закрепление определенного номера, группы и схемы дифференциальной исчерченности для всех хромосом объекта. Схемы исчерченности разрабатываются для каждого метода окраски и уровня спирализации. Разработаны принципы нумерации каждой полосы хромосомы, изменение исчерченности в зависимости от уровня спирализации, обозначение различных хромосомных перестроек. С этими принципами мы ознакомимся при изучении кариотипа человека.
Несмотря на ведущую роль хромосом в наследственности, не все эукариотические гены находятся в ядре. Существуют клеточные структуры, обладающие собственной генетической информацией.
Митохондрии имеют кольцевые мт-ДНК в количестве 2–10 копий. Количество митохондрий в клетке может достигать 1000. Размер митохондриального генома различен у разных эукариот. У млекопитающих он мал, у грибов и растений значительно больше. Например, мт-ДНК человека содержит всего 16 569 п. н., а мт-ДНК дрожжей – 78 520 п. н. В какой-то степени наблюдается закономерность: уменьшение доли генетической информации митохондрий с повышением уровня организации. Это наводит на мысль, что генетическая организация митохондрий разных организмов должна иметь определенные различия.
Хлоропласты также имеют собственную кольцевую ДНК, но значительно большего размера (до 200 000 п. н.), что позволяет ей кодировать 100–130 белков. Число копий ДНК в хлоропласте может быть весьма значительным.
Митохондрии и хлоропласты имеют собственные системы синтеза белка и синтезируют ряд белков, поэтому их относят к так называемым полуавтономным структурам. Однако следует заметить, что более 95 % митохондриальных белков кодируются в ядре.
Некоторые структуры митохондрий и хлоропластов (ДНК, рибосомы, организация генома и др.) весьма похожи на аналогичные структуры прокариот. Это явилось причиной выдвижения симбиотической теории происхождения эукариотической клетки, согласно которой полуавтономные органеллы эволюционировали от бактерий-симбионтов (Маргелис Л., 1983). У этой теории есть многочисленные приверженцы, но есть и противники.
3.3. Структура хромосом
Каждая хроматида содержит одну молекулу ДНК, связанную с белками-гистонами и негистоновыми белками. В настоящее время принята нуклеосомная модель организации хроматина эукариот (Kornberg R., 1974; Olins А., Olins D., 1974).
Согласно этой модели, белки-гистоны (они практически одинаковы у всех эукариот) формируют особые глобулы из 8 молекул в каждой глобуле (по две молекулы гистонов Н2а, Н2б, Н3, Н4). Нить ДНК делает по два витка вокруг каждой глобулы. Структура, состоящая из гистонового октамера, обвитого участком ДНК (размером 140–160 п. н.), называется нуклеосомой. Такая укладка ДНК сокращает ее длину в 7 раз. Нуклеосомная модель получила название «бусинки на нитке». Положительно заряженные гистоны и отрицательно заряженная ДНК образуют относительно прочный ДНК-гистоновый комплекс.
Участок ДНК между нуклеосомами содержит гистон Н1. Он играет важную роль в спирализации нуклеосомной нити и образовании второго уровня организации хромосом – винтообразной структуры соленоида. Последующая многоступенчатая укладка ДНК-гистоновой нити во многом остается областью, благодатной для различных гипотез. Один из вариантов изображен на рис. 3.2. Компактная упаковка генетического материала в хромосоме получила название процесса компактизации хроматина. Всего выделяют 4–5 уровней упаковки, начиная с нуклеосомного.
Степень компактизации хроматина различается в разных участках хромосом и зависит от периода клеточного цикла. Важную роль в этом процессе играют разнообразные негистоновые белки. Благодаря процессу компактизации, гигантские молекулы ДНК упакованы в клетке в небольшом объеме. Например, ДНК хромосом человека общей длиной около 1,8 м упакована в ядре диаметром менее 1 микрометра.
Необходимо отметить, что хроматин (вещество хромосом) у эукариот упакован неодинаково. Различают два типа хроматина: эухроматин (упакован менее плотно) и гетерохроматин (упакован более плотно). В свою очередь, гетерохроматин разделяют на два класса: структурный (или конститутивный) гетерохроматин (постоянно выявляемые участки) и факультативный гетерохроматин (участки обратимой компактизации эухроматиновых районов). Структурный гетерохроматин локализован в прицентромерных областях и некоторых других районах хромосом, он хорошо выявляется С-окраской. В интерфазе участки структурного гетерохроматина часто агрегируют друг с другом и образуют хромоцентры.
Считается, что гетерохроматин генетически неактивен в связи с высокой степенью конденсации, а эухроматин – активен. Но, с другой стороны, нахождение в эухроматине является недостаточным условием для экспрессии генов. Еще больше вопросов возникает при изучении функционирования гетерохроматина. Несмотря на многолетнюю историю интенсивного изучения структурно-функциональных особенностей разных видов хроматина, в этой проблеме остается много неясного.
Рис. 3.2. Уровни организации хроматина эукариот
У некоторых организмов, наряду с постоянными хромосомами, в ядрах обнаружены дополнительные хромосомы – так называемые В-хромосомы. Часто они целиком состоят из гетерохроматина. Функции их до конца не понятны.
В природе наблюдаются случаи нетипичной структуры хромосом. Поскольку такие нетипичные хромосомы имеют крупные размеры, они служат удобной моделью для изучения генома.
Хромосомы типа «ламповых щеток» представляют собой растянутый и раскрученный вариант обычных хромосом ооцитов во время длительного мейоза. Лучше всего они изучены у амфибий, в связи с их особо крупными размерами. Длина таких хромосом в 30 раз превышает их длину в обычном состоянии. Хромосомы типа «ламповых щеток» получили свое название из-за наличия петель. Петли – это участки хромосомной нити, выступающие из более компактного материала и являющиеся местом активной транскрипции. В конце мейоза хромосомы типа «ламповых щеток» возвращаются к обычному состоянию.
Политенные хромосомы образуются в некоторых клетках в результате максимальной деспирализации и многократной репликации без последующего расхождения хромосом. Это явление называется эндомитозом. Перед эндомитозом гомологичные хромосомы соединяются попарно – конъюгируют. Такая конъюгация не характерна для других соматических клеток. Все политенные хромосомы кариотипа объединяются центромерами в общий хромоцентр. Лучше всего политенные хромосомы изучены у двукрылых насекомых (в том числе у классического объекта – дрозофилы), хотя встречаются и у некоторых других организмов.
Поскольку политенные хромосомы содержат более 1000 нитей, они в 1000 раз толще обычных хромосом и у них хорошо видны участки более плотной спирализации – диски. В геноме дрозофилы выявлено около 5000 дисков – все они пронумерованы и формируют цитологические картыхромосом. Каждый диск представляет собой самостоятельную функциональную единицу, содержащую от одного до нескольких генов. Во время экспрессии активные диски «вздуваются» и образуют пуфы, которые появляются и исчезают в определенной последовательности, в зависимости от активности генов на разной стадии онтогенеза.
Цитологический анализ хромосом этих двух типов заложил основы представлений о хромомерном принципе организации хромосом. Хромомеры – это участки временно конденсированной неактивной ДНК. Расположение хромомеров для каждой хромосомы относительно постоянно. Хромомеры могут деконденсироваться и переходить в активное состояние, формируя петли, на которых происходит синтез РНК.
3.4. Клеточный цикл и митоз
В основе индивидуального развития всех организмов лежит клеточное деление. Время существования клетки от деления до деления называется клеточным (митотическим) циклом. Величина его может сильно различаться для разных организмов и для разных стадий развития. Типичный митотический цикл эукариотической клетки состоит из 4 периодов (рис. 3.3).
Пресинтетический период (G1) – наиболее длительный период клеточного цикла. Он характеризуется ростом клетки, накоплением РНК, АТФ, белков, необходимых для образования клеточных структур, подготовкой клетки к синтезу ДНК.
Рис. 3.3. Клеточный (митотический) цикл
Синтетический период (S) – период синтеза ДНК и репликации хромосом. В этот период происходит также интенсивный синтез гистонов, их перемещение в ядро, где они связываются с реплицированной ДНК. К концу периода каждая хромосома состоит из двух хроматид, имеющих идентичные копии молекулы ДНК. Таким образом, именно во время S-периода генетический материал клетки удваивается.
Постсинтетический период (G2) – период формирования структур, необходимых для процесса деления клетки. Продолжается синтез РНК и белков. Запасается энергия в виде АТФ.
Периоды G1, S, G2 иногда объединяют под названием интерфаза, однако надо заметить, что термин этот несколько устаревший, возникший в далекие времена, когда механизм клеточного деления был не изучен.
Период митоза (М) – период деления генетического материала и образования двух новых клеток. Этот период занимает менее 10 % времени клеточного цикла.
Последовательность периодов клеточного цикла можно представить следующим образом:
G1 → S → G2 → M.
Митоз – основной способ деления эукариотической клетки. В нем выделяют 4 следующие друг за другом фазы:
1. Профаза. Идет процесс прогрессивной спирализации хромосом. Исчезают ядрышки, разрушается ядерная мембрана. Образуется веретено деления, состоящее из микротрубочек. К концу про-фазы центриоли клеточного центра расходятся к полюсам клетки.
2. Метафаза. Хромосомы выстраиваются в экваториальной плоскости. В области центромеры они прикреплены к нитям веретена деления, но некоторые нити веретена проходят от полюса до полюса, не прикрепляясь к хромосомам.
3. Анафаза. Центромера делится пополам, и хроматиды начинают синхронно расходиться к полюсам клетки. С этого момента они становятся самостоятельными дочерними хромосомами. Большой теоретический интерес представляет механизм распределения хромосом, случайность или предопределенность этого процесса. Не совсем понятна роль веретена деления и центриолей. В конце анафазы на полюсах клетки группируются два идентичных хромосомных набора.
4. Телофаза. Завершается обособление двух кариотипов. Вокруг них образуются ядерные мембраны. Происходит деспирализация хромосом, формируются ядрышки. Распадается митотическое веретено деления. Завершает телофазу процесс разделения цитоплазмы – цитокинез, в котором главную роль играют структуры цито-скелета.
Данная схема митоза характерна для всех высших эукариот. Некоторые протисты и грибы имеют ряд особенностей процесса, не затрагивающих его сущность.
Основное биологическое значение митоза заключается в точном распределении генетического материала между дочерними клетками.
3.5. Мейоз
Современные представления о цитологических основах наследственности сформировались только после выяснения генетического смысла процесса мейотического деления клеток.
Мейоз – это процесс образования гаплоидных клеток, т. е. клеток, имеющих половинный набор хромосом. Его можно рассматривать как второй тип деления клеток. Мейоз также можно рассматривать и как специфичный вариант клеточной дифференцировки. Таким способом образуются половые клетки (гаметы) и споры.
Гамета – это клетка, способная сливаться с другой гаметой с образованием диплоидной клетки (зиготы), дающей новый организм.
Спора – это клетка, способная самостоятельно развиваться в новый организм.
В результате процесса мейоза из одной диплоидной клетки образуется 4 гаплоидных (гаметы или споры). У большинства организмов мейоз протекает принципиально сходно. Он состоит из двух последовательных делений: редукционное деление (мейоз-1) и эквационное деление (мейоз-2). В каждом из них различают 4 фазы: профазу, метафазу, анафазу и телофазу. Таким образом, весь процесс мейоза условно можно разбить на 8 этапов, плавно переходящих один в другой. Если другие пути на специализацию начинаются после М-периода клеточного цикла, то мейоз начинается после S-периода, т. е. после репликации хромосом.
Рис. 3.4. Синапсис гомологичных хромосом с образованием бивалентов в профазе мейоза
Профаза-1. Наиболее сложная, длительная и важная стадия мейоза. Помимо процессов, аналогичных процессам профазы митоза (спирализация хромосом, разрушение ядерной мембраны, исчезновение ядрышка, образование веретена деления), определяющее значение для всего последующего процесса имеет конъюгация гомологичных хромосом – синапсис. Соединенные пары гомологов называются бивалентами (рис. 3.4).
Гомологичные хромосомы связывает особая структура, образованная из белков кариоплазмы – синаптонемный комплекс (СК). В бивалентах гомологичные хромосомы могут обмениваться гомологичными участками. Такой процесс называется кроссинговером. Механизм кроссинговера довольно сложен. Кроссинговер вносит большой вклад в повышение генетического разнообразия, играет важную эволюционную роль и активно изучается на протяжении всей истории генетики. Однако до сих пор он сохраняет свои загадки.
В связи с длительностью и многообразием процессов профазы-1 ее обычно подразделяют на 5 подстадий.
Лептотена – начало спирализации и уплотнения хромосом.
Зиготена – начало (с отдельных участков) и завершение синапсиса гомологичных хромосом. Происходит формирование СК.
Пахитена – укорочение и утолщение бивалентов (стадия толстых нитей).
Диплотена – гомологичные хромосомы бивалентов начинают расходиться (разрушается СК), но они связаны в нескольких зонах контакта – хиазмах. Число хиазм в биваленте может быть различным (обычно 2–3), в длинных хромосомах больше, чем в коротких. Хиазмычасто показывают, что между хроматидами происходит кроссинговер.
Диакинез – хромосомы достигают максимальной спирализации. Исчезают хиазмы, и к концу диакинеза хромосомы остаются связанными только в теломерных участках.
В конце профазы-1 центриоли расходятся к полюсам клетки.
Метафаза-1. Завершается формирование веретена деления. Биваленты концентрируются в экваториальной плоскости клетки.
Анафаза-1. Гомологичные хромосомы расходятся к полюсам клетки. Каждая хромосома состоит из двух хроматид, соединенных общей центромерой.
Телофаза-1. Обычно очень короткая. У полюсов клетки группируются гаплоидные наборы хромосом, в которых представлен только один из парыгомологов. Восстанавливаются структура ядра и ядерная мембрана. Происходит частичная деспирализация хромосом. В конце телофазы-1 наступает цитокинез и образуются две клетки с гаплоидным набором хромосом.
После телофазы-1 вновь образованные клетки сразу вступают в мейоз-2, который проходит по типу обычного митоза.
Профаза-2. Частично деспирализованные хромосомы хорошо различимы. Начинается процесс обратной спирализации хромосом. Разрушается ядерная мембрана, формируется веретено деления, центриоли начинают расходиться к полюсам клетки.
Метафаза-2. Хромосомы выстраиваются в экваториальной плоскости. Центромеры прикрепляются к микротрубочкам образованного веретена деления.
Анафаза-2. Происходит разделение центромер, и каждая хроматида становится самостоятельной хромосомой. Дочерние хромосомы направляются к полюсам клетки.
Телофаза-2. Формируются новые ядра с гаплоидным набором хромосом. Хромосомы деконденсируются. Наступает цитокинез.
Основное биологическое значение мейоза заключается в обеспечении постоянства числа хромосом на протяжении поколений при половом размножении. Важным следствием мейоза является обеспечение генетического разнообразия гамет в результате рекомбинации хромосом и кроссинговера.
Механизм распределения неядерных генетических структур (митохондрий, хлоропластов) при митозе и мейозе пока неизвестен.