Цикл трикарбоновых кислот
Ацетил-СоА поступает в цикл трикарбоновых кислот, который является вторым этапом клеточного дыхания. Впервые предположение о существовании такого цикла для окисления пирувата в животных тканях было высказано в 1937 г. Гансом Кребсом. Эта идея родилась у него, когда он исследовал влияние анионов различных органических кислот на скорость поглощения кислорода суспензиями измельченных грудных мышц голубя, в которых происходило окисление пирувата. Грудные мышцы отличаются чрезвычайно высокой интенсивностью дыхания, что делает их особенно удобным объектом для изучения окислительной активности. Незадолго до описываемых работ Кребса Альберт Сент-Дьёрдьи в Венгрии обнаружил, что некоторые четырехуглеродные дикарбоновые органические кислоты, присутствующие в животных тканях (янтарная, фумаровая, яблочная и щавелевоуксусная), способны усиливать поглощение кислорода мышечной тканью. Кребс подтвердил это наблюдение и показал, что перечисленные органические кислоты стимулируют также окисление пирувата. Кроме того, он нашел, что окисление пирувата мышечной тканью стимулируется шестиуглеродными трикарбоновыми кислотами – лимонной, цис-аконитовой и изолимонной, а также пятиуглеродной α-кетоглутаровой кислотой. Испытаны были и некоторые другие встречающиеся в природе органические кислоты, но ни одна из них не обнаружила подобной активности. Обращал на себя внимание сам характер стимулирующего действия активных кислот: даже малого количества любой из них было достаточно для того, чтобы вызвать окисление во много раз большего количества пирувата.
Цикл трикарбоновых кислот выполняет несколько функций.
Во-первых, цикл трикарбоновых кислот представляет собою конечный общий путь для окисления топливных молекул. Большинство топливных молекул вступают в цикл в виде ацетил-СоА.
Во-вторых, образующиеся в реакциях цикла трикарбоновых кислот активные восстановительные эквиваленты, такие как NADH и FADH2, затем поступают в третий этап – окислительное фосфорилирование, в результате которого образуется основная масса молекул АТФ. Именно поэтому цикл трикарбоновых кислот является одним из основных путей энергетического обмена.
В-третьих, цикл трикарбоновых кислот служит также источником строительных блоков для процессов биосинтеза.
Цикл трикарбоновых кислот осуществляется в митохондрии, где располагаются ферменты, катализирующие реакции этого цикла. Большая часть ферментов располагается в матриксе митохондрии. Исключение – α-кетоглутаратдегидрогеназа и сукцинатдегидрогеназа, располагающиеся во внутренней мембране митохондрии.
Несмотря на то, что реакции замкнуты в цикл, их можно подразделить на два этапа: окисление ацетил коА до СО2 и регенерация оксалоацетата (последовательность реакций цикла трикарбоновых кислот представлена на рисунке 8).
Рисунок 8: Схема реакций цикла трикарбоновых кислот.
Первая стадия окисления ацетил-СоА начинается с начальной реакции цикла. Начальная реакция – конденсация ацетил-СоА и оксалоацетата, приводящая к образованию цитрата, катализируется конденсирующим ферментом, цитратсинтазой, при этом происходит образование связи углерод-углерод между метильным углеродом ацетил-СоА и карбонильным углеродом оксалоацетата. За реакцией конденсации, приводящей к образованию цитрил-СоА, следует гидролиз тиоэфирной связи, сопровождающийся потерей большого количества свободной энергии в форме теплоты; это определяет протекание реакции слева направо до ее завершения. Превращение цитрата в изоцитрат катализируется аконитазой (аконитатгидратазой), содержащей ион железа в Fe2+-состоянии. Ион железа является кофактором, обеспечивающим правильную организацию каталитического центра. Аконитаза относится классу лиаз, а не изомераз, как могло бы показаться на первый взгляд. Эта реакция осуществляется в две стадии: сначала происходит дегидратация с образованием цис-аконитата (часть его остается в комплексе с ферментом), а затем – гидратация и образование изоцитрата. Реакция ингибируется фторацетатом, который сначала превращается во фторацетил-СоА; последний конденсируется с оксалоацетатом, образуя фторцитрат. Непосредственным ингибитором аконитазы является фторцитрат; при ингибировании накапливается цитрат.
Среди простых соединений самым «смертельным» ядом является фторацетат натрия. LD50 (доза, летальная для 50% получивших ее животных) для крыс составляет всего лишь 0,2 мг/кг – почти в 10 раз меньше летальной дозы нервного яда диизопропилфторфосфата. Широко употребляемый (хотя и отзывы о его действии противоречивы) как яд для грызунов «1080», фторацетат был также обнаружен в листьях некоторых ядовитых растений, встречающихся в Африке, Австралии и Южной Америке. Примечательно, что дифторацетат НСР2—СОО- вообще нетоксичен. Биохимическими исследованиями установлено, что сам фторацетат не оказывает на клетки токсического действия. Токсичность проявляется лишь после метаболического превращения фторацетата в фтороцитрат, являющийся высокоспецифичным ингибитором аконитазы. Этот факт весьма примечателен, поскольку изомерный фторцитрат, образующийся в реакции фтороксалоацетата с ацетил-СоА, оказывает на тот же фермент лишь слабое ингибирующее действие, хотя как раз у этого изомера атом фтора находится на том участке, который атакуется аконитазой. Атом фтора имеет небольшой ван-дер-ваальсов радиус (0,135 нм), сравнимый с ван-дер-ваальсовым радиусом водорода (0,12 нм); на это обстоятельство часто ссылаются, когда говорят о способности фторсодержащих соединений «обманывать» ферменты. Однако более вероятно, что высокая электроотрицательность фтора и его способность к участию в водородных связях делают его в метаболическом отношении более сравнимым с – ОН-группой. В случае с фторцитратом предполагают, что ингибирующий изомер связывается с аконитазой «неправильным способом», при котором атом фтора оказывается координационно-связанным с атомом железа в активном центре аконитазы.
Эксперименты с использованием промежуточных соединений, меченных изотопом С14, показывают, что аконитаза взаимодействует с цитратом асимметрично: она всегда действует на ту часть молекулы цитрата, которая образовалась из оксалоацетата. Это сначала было трудно объяснить, так как лимонная кислота является внешне симметричным соединением. Однако положение в пространстве двух групп – СН-СООН лимонной кислоты относительно групп – ОН и – СООН неидентично. Об асимметричном действии аконитазы свидетельствует «судьбах меченого ацетил-СоА (т. е. положение атомов С14) в интермедиатах цикла лимонной кислоты. Возможно, что цис-аконитат не является обязательным интермедиатом между цитратом и изоцитратом и образуется на боковой ветви основного пути.
Образовавшийся изоцитрат окисляется под действием изоцитратдегидрогеназы до оксалосукцината или α-кетоглутарата. Окислению подвергается гидроксильная группа изоцитрата, образующаяся в результате кето-группа дестабилизирует карбоксильную группу во втором положении, это приводит к декарбоксилированию. Карбоксильная группа отщепляется в виде молекулы углекислого газа. Это первая молекула СО2, образующаяся при окислении ацетил-СоА. Важным компонентом реакции декарбоксилирования являются ионы Мn2+ (или Mg2+). Акцептором протонов и электронов является молекула NAD+, в результате образуется NADH. Описаны три различных формы изоцитратдегидрогеназы. Одна из них, NAD+-зависимая, найдена только в митохондриях. Две другие формы фермента являются NADP+-зависимыми, причем одна из них также находится в митохондриях, а другая в цитозоле. Окисление изоцитрата, связанное с работой дыхательной цепи, осуществляется почти исключительно NAD+-зависимым ферментом.
Образовавшийся в результате окисления изоцитрата α-кетоглутарат подвергается окислительному декарбоксилированию, сходному с окислительным декарбоксилированием пирувата. Окислительное декарбоксилирование α-кетоглутарата катализируется α-кетоглутарат-дегидрогеназным комплексом, сходным по структуре с пируват-дегидрогеназным комплексом. В состав α-кетоглутарат-дегидрогеназного комплекса входят три вида ферментов: α-кетоглутарат-дегидрогеназный, транссукцинилазный и дигидролипоил-дегидрогеназный компоненты. Ядро комплекса составляет транссукцинилаза (аналогично трансацетилазе). α-Кетоглутарат – дегидрогеназный компонент и транссукцинилаза отличаются от соответствующих ферментов пируват-дегидрогеназного комплекса. В то же время дигидролипоил-дегидрогеназные части обоих комплексов идентичны. Видно, что пируват- и α-кетоглутарат-дегидрогеназные комплексы представляют собою гомологичные ассоциации ферментов. Структурные и механистические особенности, обеспечивающие координированный катализ на входе в цикл трикарбоновых кислот, вновь используются позднее в процессе функционирования этого цикла. Равновесие реакции настолько сильно сдвинуто в сторону образования сукцинил-СоА, что ее можно считать физиологически однонаправленной. Как и при окислении пирувата, реакция ингибируется арсенатом, что приводит к накоплению субстрата (α-кетоглутарата). Реакция окисления α-кетоглутарата с образованием сукцинил-СоА является реакцией окислительного декарбоксилирования с образованием параллельно молекул СО2 и NADH. Это последняя реакция первого этапа цикла.
Все последующие реакции относятся ко второму этапу цикла – регенерации оксалоацетата.
Продолжением цикла является превращение сукцинил-СоА в сукцинат, катализируемое сукцинаттиокиназой (сукцинил-СоА-синтетазой). Одним из субстратов реакций является ГДФ (или ИДФ), из которого в присутствии неорганического фосфата образуется ГТФ (ИТФ). Это – единственная стадия цикла лимонной кислоты, в ходе которой генерируется высокоэнергетическая фосфатная связь на субстратном уровне; при окислительном декарбоксилировании α-кетоглутарата потенциальное количество свободной энергии достаточно для образования NADH и высокоэнергетической фосфатной связи. В реакции, катализируемой фосфокиназой, АТФ может образовываться как из ГТФ, так и из ИТФ.
Сукцинаттиокиназа – фермент, располагающийся в печени. В альтернативной реакции протекающей во всех других тканях кроме печени и катализируемой сукцинилСоА-ацетоацетат-СоА-трансферазой (тиофоразой), сукцинил-СоА превращается в сукцинат сопряженно с превращением ацетоацетата в ацетоацетил-СоА. В данной реакции нуклеозидтрифосфаты не образуются, но эта реакция используется для активации ацето-ацетата, что важно для обмена липидов, который будет подробно рассмотрен ниже.
Далее сукцинат дегидрогенируется с образованием фумарата. Дегидрогенирование катализируется сукцинатдегидрогеназой, связанной с внутренней поверхностью внутренней митохондриальной мембраны. Это единственная дегидрогеназная реакция цикла лимонной кислоты, в ходе которой осуществляется прямой перенос водорода с субстрата на флавопротеин без участия NAD+. Фермент содержит FAD+ и железо-серный (Fe-S) белок. В рзультате окисления сукцината до фумарата образуется FADH2. Добавление малоната или оксалоацетата ингибирует сукцинатдегидрогеназу, что приводит к накоплению сукцината.
Фумараза (фумаратгидратаза) катализирует присоединение воды к фумарату с образованием малата. Фумараза специфична к L-изомеру малата, она катализирует присоединение компонентов молекулы воды по двойной связи фумарата в транc-конфигурации. Образовавшийся малат окисляется с образованием оксалоацетата, в результате происходит замыкание цикла трикарбоновых кислот.
Реакцию окисления малата осуществляет малатдегидрогеназа. Малатдегидрогеназа катализирует превращение малата в оксалоацетат, реакция идет с участием NAD+. Хотя равновесие этой реакции сильно сдвинуто в направлении малата, реально она протекает в направлении оксалоацетата, поскольку он вместе с NADH постоянно потребляется в других реакциях.
Ферменты цикла лимонной кислоты, за исключением α-кетоглутарат и сукцинатдегидрогеназы, обнаруживаются и вне митохондрий. Однако некоторые из этих ферментов (например, малатдегидрогеназа) отличаются от соответствующих митохондриальных ферментов.
Таким образом, два атома углерода поступают в цикл в виде ацетил-СоА и два атома углерода покидают цикл в виде СО2 при последовательных реакциях декарбоксилирования.
Суммарная реакция цикла трикарбоновых кислот:
Ac-СoA+3NAD++FAD++ГДФ →2CO2+3NADH+FADH2+ГТФ
Суммарная реакция полного окисления глюкозы до CO2:
Глюкоза +2АТФ +10NAD+ +2FAD+ +4АДФ+2ГДФ→ 6CO2+2АДФ +4АТФ +10NADH+2FADH2+2ГТФ
Регуляция скорости цикла трикарбоновых кислот
Регуляция скорости цикла трикарбоновых кислот осуществляется на уровне регуляции скорости нескольких реакций цикла. В большинстве случаев скорость функционирования метаболических циклов определяется их начальными этапами.
Полагают, что так же обстоит дело и в случае цикла лимонной кислоты. Общая скорость его функционирования во многих тканях определяется первой реакцией: синтезом цитрата. Разумеется, скорость цитратсинтазной реакции регулируется концентрацией ее субстратов, в частности концентрацией ацетил-СоА, а она в свою очередь зависит от активности пируватдегидрогеназного комплекса. Регулируется эта реакция также концентрацией второго субстрата – оксалоацетата; возможно даже, что этот фактор играет главную роль, поскольку концентрация оксалоацетата в митохондриях очень низка и зависит от метаболических условий. На активность цитратсинтазы влияет также концентрация сукцинил-СоА, одного из более поздних промежуточных продуктов цикла. Как только концентрация сукцинил-СоА превышает нормальный стационарный уровень, цитратсинтаза сразу же ингибируется, поскольку сукцинил-СоА понижает ее сродство к ацетил-СоА, то есть сукцинил-СоА является отрицательным аллостерическим регулятором (ингибитором) цитратсинтазы, уменьшающим ее активность. Жирные кислоты, служащие предшественниками ацетил-СоА тоже ингибируют цитратсинтазу, являясь отрицательными аллостерическими эффекторами. В некоторых клетках роль аллостерических ингибиторов цитратсинтазы играют цитрат и NADH.
У большей части клеток окисление изоцитрата до α-кетоглутарата и CO2, которое может происходить под действием двух разных изоцитратдегидрогеназ, регулируется, по-видимому, путем аллостерической стимуляции NAD-зависимого фермента, вызываемой AДФ. В то же время NADH и NADPH действуют как отрицательные аллостерические модуляторы изоцитратдегидрогеназной активности.
Ингибитором активности α-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса служит продукт реакции сукцинил-СоА. Таким образом, в цикле лимонной кислоты регулируются, по меньшей мере, три стадии, и только в своих деталях эта регуляция у разных типов клеток несколько различается.
Скорость гликолиза в нормальных условиях согласована со скоростью функционирования цикла лимонной кислоты: в клетке до пирувата расщепляется ровно столько глюкозы, сколько необходимо для того, чтобы обеспечить цикл лимонной кислоты «топливом», т. е. ацетильными группами ацетил-СоА. Ни пируват, ни лактат, ни ацетил-СоА обычно не накапливаются в аэробных клетках в больших количествах; их концентрации поддерживаются на некоем постоянном уровне, соответствующем динамическому равновесию. Согласованность между скоростью гликолиза и скоростью функционирования цикла лимонной кислоты объясняется не только тем, что первый процесс ингибируется высокими концентрациями АТФ и NADH, т. е. компонентами, общими для гликолитической и дыхательной стадий окисления глюкозы; определенную роль в этой согласованности играет также и концентрация цитрата. Продукт первой стадии цикла лимонной кислоты – цитрат является аллостерическим ингибитором фосфофруктокиназы, катализирующей в процессе гликолиза реакцию фосфорилирования фруктозо-6-фосфата.
Механизмы анаплеротических реакций
Цикл лимонной кислоты – это еще и один из амфиболических путей. Он используется не только для окислительного катаболизма, т. е. для расщепления углеводов, жирных кислот и аминокислот, но может служить также первой стадией многих биосинтетических путей, для которых он является источником предшественников. Под воздействием ряда важных вспомогательных ферментов некоторые промежуточные продукты цикла лимонной кислоты, главным образом α-кетоглутарат, сукцинат и оксалоацетат, могут удаляться из цикла и использоваться в качестве предшественников аминокислот. Скорость функционирования цикла лимонной кислоты при этом, казалось бы, должна снижаться, поскольку такой отток промежуточных продуктов из цикла должен понижать их концентрацию в клетке. В действительности же этого не происходит, так как убыль промежуточных продуктов цикла восполняется благодаря действию другого набора ферментов. При нормальных условиях реакции, отвлекающие промежуточные продукты из цикла, и реакции, восполняющие их убыль, находятся в состоянии динамического равновесия, так что концентрация этих продуктов в митохондриях остается более или менее постоянной.
Специальные ферментативные реакции, обеспечивающие пополнение пула промежуточных продуктов цикла лимонной кислоты, носят название анаплеротических («пополняющих») реакций. Наиболее важная реакция такого рода в животных тканях это ферментативное карбоксилирование пирувата за счет СО2 с образованием оксалоацетата катализирует эту обратимую реакцию фермент пируваткарбоксилаза. Если для цикла лимонной кислоты не хватает оксалоацетата или какого-нибудь другого промежуточного продукта цикла, то карбоксилирование пирувата стимулируется и запас оксалоацетата растет. Для ферментативного присоединения карбоксильной группы к молекуле пирувата требуется энергия. Источником ее служит сопряженное с данной реакцией расщепление АТФ до AДФ и фосфата. Поскольку суммарная реакция сопровождается лишь незначительным изменением стандартной свободной энергии, мы можем заключить, что свободная энергия, необходимая для присоединения карбоксильной группы к пирувату, примерно равна свободной энергии, выделяющейся при гидролизе АТФ. Пируваткарбоксилаза очень сложный фермент. Его молекулярная масса равна приблизительно 650000 Da. Молекула фермента содержит четыре кофермента. Каждый из них состоит из одной молекулы витамина биотина, ковалентно связанного (пептидной связью) с аминогруппой особого остатка лизина, находящегося в активном центре. Свободный СО2, предшественник новой карбоксильной группы оксалоацетата, сначала активируется путем присоединения к одному из атомов азота в молекуле биотина. Эта активация, связанная с расходованием АТФ, составляет первую стадию реакции, катализируемой пируваткарбоксилазой. На второй стадии, протекающей также в активном центре фермента, новая карбоксильная группа, ковалентно связанная с простетической группой фермента, переносится на пируват с образованием оксалоацетата. Пируваткарбоксилаза принадлежит к регуляторным ферментам. В отсутствие ацетил-СоА, который служит для нее положительным модулятором, скорость катализируемой ею прямой реакции, приводящей к образованию оксалоацетата, очень невелика. Избыток же ацетил-СоА. поставляющего «топливо» для цикла лимонной кислоты, стимулирует пируваткарбоксилазную реакцию; в результате этого образуется больше оксалоацетата и цикл использует больше ацетил-СоА в цитратсинтазной реакции. Пируваткарбоксилазная реакция – главная анаплеротическая реакция в печени и почках. В миокарде и в мышцах протекают другие анаплеротические реакции. Одна из таких реакций катализируется фосфоенолпируваткарбоксикиназой. В этой реакции происходит расщепление фосфоенолпирувата – сверхвысокоэнергетического фосфорилированного соединения, образующегося в процессе гликолиза. Высвобождаемая энергия используется для карбоксилирования с образованием оксалоацетата, а ее остаток запасается в форме ГТФ.
Глиоксилатный цикл – одна из модификаций цикла лимонной кислоты
У растений и некоторых микроорганизмов, например у Е. coli, ацетильные группы часто служат не только высокоэнергетическим «топливом», но и источником метаболитов, из которых строятся углеродные скелеты углеводов. В таких клетках действуют два варианта цикла лимонной кислоты: 1) обычная последовательность реакций, в ходе которой происходит окисление ацетил-СоА до СО2 свойственная большинству тканей, и 2) особая ее модификация, называемая глиоксилатным циклом (последовательность реакций глиоксилатного цикла представлена на рисунке 9).
Рисунок 9: Схема реакций глиоксилатного цикла
В глиоксилатном цикле ацетил-СоА взаимодействует с оксалоацетатом, в результате чего образуется цитрат. Однако расщепление изоцитрата происходит не в обычной изоцитратдегидроненазной реакции, как в цикле лимонной кислоты, а особым путем под действием фермента изоцитратлиазы с образованием сукцината и глиоксилата. Образовавшийся глиоксилат далее конденсируется с другой молекулой ацетил-СоА, что приводит к образованию малата, эта реакция катализируется малатсинтазой. Затем малат окисляется до оксалоацетата, который может конденсироваться с новой молекулой ацетил-СоА, начиная тем самым новый оборот цикла.
При каждом обороте глиоксилатного цикла в него вступают две молекулы ацетил-СоА и образуется одна молекула сукцината, которая затем используется в процессах биосинтеза. Сукцинат может превращаться через фумарат и малат в оксалоацетат из которого образуется фосфоенолпируват путем обращения описанной выше фосфоенолпируваткарбоксикиназной реакции. Фосфоенолпируват используется в качестве предшественника при биосинтезе глюкозы.
У животных глиоксилатный цикл отсутствует; изоцитратсинтазы и малатлиазы в животных клетках нет. В организме животных существуют другие пути для синтеза углеводов из простых предшественников.
В прорастающих семенах глиоксилатный цикл, напротив, функционирует очень активно: таким путем из ацетильных групп (источником которых служат жирные кислоты, входящие в состав запасных триацилглицеролов) образуется глюкоза. Ферменты изоцитратлиаза и малатсинтаза находятся в растительных клетках в особых цитоплазматических органеллах глиоксисомах.