Биохимия метаболизма. Учебное пособие. Дыхательная цепь и окислительное фосфорилирование (Е. А. Бессолицына)

Как было рассмотрено ранее, суммарная реакция окисления глюкозы до CO₂ в реакциях гликолиза и цикле трикарбоновых кислот выглядит следующим образом:

Глюкоза +10NAD⁺ +2FAD⁺ +2АДФ+2 ГДФ = 6 CO₂ +10NADH +2FADH₂ +2ГТФ +2ATФ

Как видно из суммарной реакции энергетический выход данного процесса окисления невелик: 2 АТФ из гликолиза и 2 ГТФ из цикла трикарбоновых кислот, если цикл идет в печени, то есть только в печеночной ткани цикл трикарбоновых кислот дает энергетический выход в виде нуклеозидтрифосфатов. При этом основным продуктом окисления являются восстановленные доноры/акцепторы электронов или NADH и FADH₂, поэтому важным фактором является доказательство возможности использовать данные молекулы в качестве источника энергии. Хотя в составе данных молекул присутствуют фосфоангидридные связи, характерные для нуклеозидтрифосфатов, и, следовательно, данные молекулы могут быть донорами энергии как АТФ, но гидролиз данных молекул не является экономически выгодным, так как затраты на синтез этих молекул слишком велик.

Вторая проблема связана с тем, что гидролиз связи может происходить как в окисленной, так и в восстановленной молекуле, следовательно, с такой точки зрения цикл трикарбоновых кислот становится бессмысленным, что для природы не характерно.

Из этого можно сделать вывод, что запасание энергии связано с процессом восстановления окислительно-восстановительных эквивалентов NAD⁺ и FAD⁺ и окислительно-восстановительными реакциями.

Основным параметром в окислительно-восстановительных реакциях является их способность отдавать (быть восстановителем) или принимать (быть окислителем) электроны в ходе реакции. Экспериментальной характеристикой этих способностей молекул является окислительно-восстановительный потенциал или red/ox потенциал.

Окислительно-восстановительные потенциалы и изменения свободной энергии

Окислительно-восстановительный потенциал – это электрохимическая категория. Необходимо рассмотреть для примера вещество, которое может существовать в окисленной X⁺ и в восстановленной форме Х. Такая пара называется окислительно-восстановительной парой (схема эксперимента для определения окислительно-восстановительного потенциала представлена на рисунке 10).

Рисунок 10: Структура эксперимента метода полукамер для определения окислительно-восстановительного потенциала

Окислительно-восстановительный потенциал такой пары можно определить, измеряя электродвижущую силу, развиваемую опытной полукамерой по отношению к стандартной контрольной полукамере. Опытная полукамера представляет собою электрод, погруженный в раствор 1 М окислителя (X⁺) и 1 М восстановителя (X). Стандартная контрольная полукамера состоит из электрода, погруженного в 1 М раствор Н⁺, находящийся в равновесии с газообразным Н₂ при давлении в 1 атм. Электроды присоединяют к вольтметру и агаровым мостиком обеспечивают электропроводность между полукамерами. Происходит поток электронов oт одной полукамеры к другой. Если реакция идет в направлении

то в полукамерах будут происходить следующие реакции:

Таким образом, электроны движутся от опытной полукамеры к контрольной и, следовательно, электрод в опытной полукамере заряжен отрицательно по отношению к электроду стандартной полукамеры. Окислительно-восстановительный потенциал пары X⁺:X соответствует напряжению в начале эксперимента (когда концентрации X⁺, X и Н⁺ равны 1 М). Окислительно-восстановительный потенциал пары Н⁺:Н₂ определен равным 0 В (вольт).

Значение окислительно-восстановительного потенциала теперь очевидно. Отрицательный окислительно-восстановительный потенциал говорит о том, что данное вещество имеет меньшее сродство к электронам, чем Н₂ (как в вышеприведенном примере), то есть молекула является донором электронов, то есть восстановителем. Положительный окислительно-восстановительный потенциал свидетельствует о более высоком, чем у Н₂, сродстве данного вещества к электронам, то есть является окислителем или молекулой, с большей легкостью присоединяющей электроны. Эти соотношения относятся к стандартным условиям, когда концентрации окислителя, восстановителя и Н⁺ равны 1 М и давление Н₂ составляет 1 атм.

Таким образом, сильный восстановитель (например, NADH) обладает отрицательным окислительно-восстановительным потенциалом, тогда как сильный окислитель (О₂) имеет положительный окислительно-восстановительный потенциал. Окислительно-восстановительные потенциалы многих биологически важных окислительно-восстановительных пар известны.

Изменение свободной энергии окислительно-восстановительной реакции можно легко вычислить из разности окислительно-восстановительных потенциалов реагирующих соединений.

Любую окислительно-восстановительную реакцию в общем виде можно представить следующим образом:

Сначала нужно ввести обозначения: окислитель⁺ – окисленная форма окислителя, окислитель – восстановленная форма окислителя, восстановитель – восстановленная форма восстановителя, восстановитель⁺ – окисленная форма восстановителя. Запишем общую реакцию, испльзуя обозначения:

окислитель⁺ + восстановитель → окислитель +восстановитель⁺ (реакция А)

Любую окислительно-восстановительную реакцию разделяют на две полу-реакции, каждая из которых представляет собой обмен электронами между окисленной и восстановленной формами окислительно восстановительной пары, чей потенциал можно измерить в эксперименте, описанном выше:

окислитель⁺ + ē → окислитель (реакция Б)

Окислительно восстановительный потенциал этой пары Е₁ восстановитель⁺ + ē→ восстановитель (реакция В)

Окислительно восстановительный потенциал этой пары Е₂

Вычитая реакцию в) из реакции б), получаем желаемую реакцию а) и ΔE»_о

Теперь можем рассчитать ΔG⁰» для восстановления пирувата за счет NADH. Изменение стандартной свободной энергии ΔG⁰» связано с изменением окислительно-восстановительного потенциала ΔE'_о уравнением

ΔG⁰ = -nF ΔE»_о

где n- число переносимых электронов, F-число Фарадея (23,062 ккал • В ^-1 • моль ^-1), ΔE'_о выражается в вольтах, ΔG⁰ в килокалориях на моль.

Величина окислительно-восстановительного потенциала дыхательной цепи составляет 1,14 В, что соответствует 53 ккал.

Изменение окислительно-восстановительного потенциала при переходе от системы NAD⁺/NADH к системе О₂/Н₂О составляет 1,1 В.

Движущая сила окислительного фосфорилирования – это потенциал переноса электронов, присущий NADH или FADH₂. Рассчеты ΔE'_о и ΔG⁰ связанные с окислением NADH под действием О₂. Промежуточные частичные реакции следующие:

а) 1/2О₂ +2Н⁺ +2 ē→ Н₂О

E«_о = +0,82 В,

б) NAD⁺ + Н⁺ +2 ē→ NADH

E«_о = – 0,32 В.

Вычитая реакцию б) из реакции а), получаем

в) 1/2 О₂ + NADH + Н⁺ → Н₂О + NAD ⁺

ΔE'_о = +1,14 В.

Свободная энергия окисления для этой реакции составляет

ΔG⁰ = -2—23,062.1,14 = – 52,6 ккал/моль.

Таким образом доказано, что молекула NADH является источником энергии, и, как показывают расчеты, при окислении этой молекулы с участием кислорода выделяется такое количество энергии, которое достаточно для синтеза 7 молекул АТФ. Но реакция происходит взрывообразно, и это не позволяет перевести энергию в более адекватную форму.

Чтобы обеспечить перевод энергии окисления в энергию АТФ необходима система окисления, это обеспечивает дыхательная цепь, состоящая из 4-х белковых комплексов, содержащих коферменты, участвующие в окислительно-восстановительных реакциях. В результате мы имеем с одной стороны материальную группу молекул, передающих электроны друг от друга, то есть образуется система передачи электронов от NADH к О₂ по которому идут электроны, как электрическая цепь в сети, с другой стороны это последовательность окислительно-восстановительных реакций, которые происходят в составе электронтранспортной цепи, молекулы коферментов являются окислителями (акцепторами электронов) при взаимодействии с предшествующими молекулами, и являются восстановителями (донорами электронов) при взаимодействии со следующей молекулой цепи.

Из этого заключаем, что каждый следующий кофермент является большим окислителем, чем предыдущий, то есть этот кофермент «отбирает» электроны у предыдущего кофермента, а у него электроны «отбирает» следующий кофермент в электронтранспортной цепи. В данном случае наблюдается увеличение окислительно-восстановительного потенциала, следовательно, каждый следующий кофермент в электронтранспортной цепи является большим окислителем, и, как следствие, электронтранспортная цепь не только физическая часть для потока электронов, но и последовательность окислительно-восстановительных реакций.

Организация электронтранспортной цепи

Электронтранспортная цепь организована во внутренней мембране митохондрий и представляет собой четыре белковых комплекса, содержащих коферменты, окислительно-восстановительных реакций (общий план организации и функционирования электрон-транспортной цепи изображен на рисунке 11).

Рисунок 11: Схема общей организации дыхательной цепи (источник: Скулачев В. П., Богачев А. В., Каспаринский Ф. О. Мембранная биоэнергетика М.: Издательство МГУ, 2012)

Первый комплекс – NADH-дегидрогеназа (комплекс I), сукцинат-дегидрогеназа (комплекс II), убихинон-цитохром с редуктаза (комплекс III), цитохром оксидаза (комплекс IV).

NADH-дегидрогеназа (комплекс I) включает в себя флавинмононуклеотид (FMH) и как минимум шесть Fe-S комплексов. Известны три вида Fe-S-центров. В простейшем случае единственный атом железа тетраэдрически координирован с сульфогидрильными группами четырех цистеиновых остатков белка. Второй вид комплексов (обозначен как Fe₂-S₂) содержит 2 атома железа и два неорганических дисульфида, присоединенных к четырем цистеиновым остаткам. В комплексах третьего вида (Fe₄-S₄) содержится четыре атома железа, четыре неорганических сульфида и четыре остатка цистеина. В состав NADH-дегидрогеназы входят два кофермента класса Fe₂-S₂, и четыре класса Fe₄-S₄ (Схема организации и функционирования коферментов комплекса I представлена на рисунке 12).

Рисунок 12: А – схема окислительно-восстановительных реакций в комплексе I; Б – структура FeS коферментов

Сукцинат-дегидрогеназа (комплекс II) состоит из 4 субъединиц с молекулярными массами 70, 30, 14 и 12 кDa и содержит в качестве окислительно-восстановительных групп флавинадениндинуклеотид (FAD), ковалентно связанный с самой тяжелой субъединицей, и 3 Fe-S-кластера (один Fe₂-S₂ и два Fe₄-S₄), ассоциированных с субъединицей с молелекулярной массой 30 кDa.

Комплекс I обеспечивает окисление молекулы NADH, а комплекс II окисляет молекулу FADH₂, электроны поступают на коферменты электрон-транспортной цепи и в конце концов поступают на молекулу убихинона или кофермента Q. Кофермент Q – хиноновое производное с длинным изопреноидным хвостом. Его называют также убихиноном из-за его повсеместного распространения в биологических системах.

Число изопреновых единиц в коферменте Q зависит от вида живых организмов, У млекопитающих его наиболее распространенная форма содержит десять изопреновых единиц и обозначается как Q₁₀. Изопреноидный хвост обуславливает высокую неполярность Q, которая способствует его быстрой диффузии в углеводородной фазе внутренней митохондриальной мембраны. Кофермент Q является компонентом митохондриальных липидов; среди других липидов преобладают фосфолипиды, являющиеся частью митохондриальной мембраны. Структура кофермента Q сходна со структурой витаминов К и Е.

Близкую структуру имеет и пластохинон, находящийся в хлоропластах. Все эти вещества имеют в своей структуре полиизопреноидную боковую цепь. Содержание кофермента Q значительно превосходит содержание других компонентов дыхательной цепи (по параметру стехиометрии); это позволяет предположить, что кофермент Q является подвижным компонентом дыхательной цепи, который получает восстановительные эквиваленты от фиксированных флавопротеиновых комплексов и передает их на цитохромы. Кофермент Q-единственный переносчик электронов в дыхательной цепи, который не связан прочно с белком и не присоединен к нему ковалентно. Кофермент Q действительно служит высокомобильным переносчиком электронов между флавопротеинами и цитохромами цепи переноса электронов.

Убихинон-цитохром с редуктаза (комплекс III) включает 11 субъединиц с молекулярным весом: 49,5, 47, 44, 28, 21,5, 13,5, 9,5, 9, 8, 7, 6,5 kDa соответственно. Третья субъединица весом 44 kDa присоединяет две молекулы гемов b_H и b_L. Центральную роль цитохромов в дыхании открыл в 1925 г. Дэвид Кейлин (David Keilin).

Цитохром – это переносящий электроны белок, молекула которого содержит в качестве простетической группы гем.

Гем – это модифицированная молекула тетрапиррольного кольца, в центре которой ассоцииирован ион металла (это могут быть ионы железа, меди и других металлов). В зависимости от радикалов, модифицирующих кольцо, и от ионов ассоцированных с кольцом гема, выделяют несколько классов цитохромов. Субъединица V или белок Риске содержит Fe₂-S₂ кластер. Субъединица VI связывает убихинон, субъединица IV координирует цитохром с. Функции остальных субъединиц не выявлены или участвуют в организации комплекса (схема функционирования убихинона и коферментов комплекса III представлена на рисунке 13).

Рисунок 13: А – схема окислительно-восстановительной реакции с убихиноном; Б – схема окислетельно-восстановительных реакций между FeS белком и убихиноном, между убихиноном и гемом; В – структура гема в цитохромах

Электроны с убихинон-цитохром с редуктазы переносятся на цитохром с. Цитохром с – водорастворимый, подвижный белок с молекулярной массой 12 kDa. Этот белок мигрирует между комплексами III и IV в межмембранном пространстве.

Цитохром оксидаза (комплекс IV) содержит восемь белковых субъединиц, с ними ассоциированы два гема, содержащих ионы меди, которые называют гемы а и а3. Кроме этого содержит два иона меди Cu_A и Сu_B. Центр Сu_B представляет ион меди соединенный с радикалами трех остатков гистидина. Центр Cu_A содержит два атома меди расположенных очень близко и скоординированных с белком (схема функционирования коферментов комплекса IV представлена на рисунке 14).

Рисунок 14: Схема функционирования коферментов комплекса IV

Механизмы переноса электронов в электронтранспортной цепи

Первый комплекс или NADH-дегидрогеназа взаимодействует с молекулой NADH, электроны переносятся на (FMN), в результате FMN принимает с NADH два электрона и два протона от среды, и образуется NAD+ и FMNH₂, затем электроны переносятся на первый комплекс Fe₄-S₄ белка в результате происходит окисление FMNH₂ и перенос электронов на ион железа Fe-S белка, далее железо в комплексе восстанавливается из положения Fe³⁺ до Fe²⁺. Это происходит потому, что окислительно-восстановительный потенциал NADH меньше, чем у FMN, поэтому происходит окисление NADH флавинмононуклеотидом, который затем окисляется Fe₄-S₄ белком, чей окислительно-восстановительный потенциал еще больше. Далее происходит серия окислительно-восстановительных реакций с участием Fe-S белков, каждый из которых является большим окислителем, чем предыдущий.

В результате восстановленный ион железа Fe²⁺ Fe-S белка предшественника, окисляется до положения Fe³⁺, следующим цепи транспорта электронов Fe-S белком, чей окислительно-восстановительный потенциал выше, чем у предшественника, в результате ион железа окислителя восстанавливается из положения Fe³⁺ с Fe²⁺.

Особенностью флавинмононуклеотида является способность переносить два электрона, как и другие нуклеотидсодержащие коферменты, тогда как железо-серные белки переносят только по одному электрону, именно поэтому флавинмононуклеотид является адаптором процесса электронов с NADH на Fe-S белки.

Затем происходит последовательный перенос с одного Fe-S белка на другой, где один ион железа окисляется, а второй восстанавливается. Точно также ион железа Fe-S белка восстановителя окисляется из Fe²⁺ в Fe³⁺, а в белке окислителе восстанавливается из Fe³⁺ в Fe²⁺. Конечным акцептором является Fe₄-S₄ белок, чья восстановленная Fe²⁺ форма, окисляется до Fe³⁺ убихиноном, который обладает большим окислительно-восстановительным потенциалом. В результате окисленная форма хинона Q переходит в восстановленную QH₂.

Вторым источником электронов для убихинона является сукцинатдегидрогеназа: фермент цикла трикарбоновых кислот. Два электрона переносятся с сукцината на FAD в цикле трикарбоновых кислот. В результате FAD восстанавливается до FADH₂, который окисляется Fe-S-белками, каждый из которых является большим окислителем и точно также происходит перенос электронов на ион железа в Fe-S-белках, а в конце концов на убихинон, который в результате восстанавливается до QH₂.

Восстановленный убихинон (QH₂) диффундирует к комплексу III, где связывается с субъединицей QIII, где происходит окисление восстановленного убихинона, протоны высвобождаются в межмембранное пространство, а электроны поступают на электронтранспортную цепь.

Один электрон поступает на на ген b_L, а затем гем b_H, а потом на хинон для дальнейшего восстановления за счет работы комплекса I или комплекса II. А вот второй электрон поступает на Fe-S белок, в результате происходит восстановление иона железа из Fe³⁺ до Fe²⁺, так как этот комплекс более сильный окислитель. Далее Fe-S белок окисляется цитохромом с₁, содержащим в составе гема ион железа. В ходе реакции ион железа в Fe-S белке окисляется от Fe²⁺ в Fe³⁺, а в цитохроме с₁ ион железа восстанавливается Fe³⁺ до Fe²⁺. Затем цитохром с₁ окисляется подвижным цитохромом с, также содержащим ион железа, который восстанавливается до положения Fe²⁺.

Цитохром с мигрирует к последнему комплексу IV (цитохромоксидазе). Взаимодействуя с цитохромоксидазой цитохром с окисляется ионом меди в комплексе Cu_A. В результате ион железа в цитохроме с окисляется от Fe²⁺ в Fe³⁺ а ион меди в Cu_A восстанавливается Cu²⁺ в Cu⁺. В свою очередь комплекс окисляется ионом железа в геме а. А ион железа в составе гема а окисляется ионом железа в геме а₃, который востанавливается.

Восстановленный ион железа в геме а₃ окисляется ионом меди в комплексе Cu_B. Ион меди в этом в этом комплексе восстанавливается, а затем окисляется кислородом, параллельно присоединяя четыре протона, с образованием двух молекул воды.

Таким образом происходит перенос электронов от NADH к кислороду, то есть потока электронов или цепи последовательных окислительно-восстановительных реакций, где почти каждая молекула является акцептором электронов в предшествующей реакции и донором в последующей.

Как было рассмотрено выше, в ходе окислительно-восстановительных реакций также выделяется и поглощается энергия, в начальных этапах исследований считалось, что выделившаяся энергия затрачивается на синтез некоего макроэргического соединения, которое, гидролизуясь, дает энергию для фосфорилирования АДФ и образования АТФ. Но дальнейшие исследования показали, что на самом деле никакого соединения нет. А все экспериментальные исследования подтвердили гипотезу, а затем теорию предложенную в 1961 году Питером Митчеллом.

Хемиосмотическая гипотеза Митчелла

Митчелл предположил, что сопряжение переноса электронов и синтеза АТФ обеспечивается протонным градиентом, а не высокоэнергетическим ковалентным промежуточным продуктом или активированным белком. Согласно этой модели, перенос электронов по дыхательной цепи приводит к выбросу протонов из матрикса на цитоплазматическую сторону внутренней митохондриальной мембраны, где, таким образом, возрастает концентрация ионов Н⁺. В результате происходит генерирование мембранного потенциала с положительным зарядом на цитоплазматической стороне мембраны.

Гипотеза Митчелла о сопряжении окисления и фосфорилирования протонным градиентом получила к настоящему времени множество подтверждений.

1. Согласно Митчеллу, первичным событием в окислительном фосфорилировании является транслокация протонов (Н⁺) на наружную сторону сопрягающей мембраны (внутренней митохондриальной мембраны), осуществляемая за счет процесса окисления в дыхательной цепи. При этом предполагается, что мембрана непроницаема для ионов вообще, особенно для протонов, которые накапливаются на наружной стороне мембраны, создавая по обе стороны мембраны разность электрохимических потенциалов (Δμн). Она складывается из химического потенциала (разность рН) и электрического потенциала.

Разность электрохимических потенциалов обеспечивает действие локализованной в мембране АТФ-синтазы (или обращение процесса, катализируемого локализованной в мембране АТФ-гидролазой), которая в присутствии Ф_н -+ AДФ синтезирует ATФ. Таким образом, нет необходимости в высокоэнергетическом промежуточном соединении, общем для процессов окисления и фосфорилирования, как это постулирует химическая гипотеза.

Протонный градиент через внутреннюю митохондриальную мембрану создается во время переноса электронов. рН с наружной стороны на 1,4 единицы ниже, чем с внутренней, и мембранный потенциал составляет 0,14 В, причем наружная сторона несет положительный заряд. Общий электрохимический потенциал Δр (в вольтах) складывается из мембранного потенциала (ΔΨ) и градиента концентрации ионов Н ⁺ (ΔрН). В приведенном ниже уравнении R-газовая постоянная, Т – абсолютная температура, F- число Фарадея.

как видно из уравнения в него входят два компонента электрический (Δψ) и химический (RT/F*ΔрН). Электрический компонент связан с запасанием энергии, в данном случае наблюдается следующая картина:, за счет переноса протонов, водный раствор межмембранного пространства заряжен положительно, а водная часть матрикса митохондрии наоборот отрицательно, а мембрана за счет гидрофобного билипидного слоя выступает в роли прослойки из диэлектрика (это похоже на две заряженные пластины, разделенные слоем диэлектрика – а это уже конденсатор). В случае разницы в концентрациях протонов между двумя указанными выше компартментами – это тоже форма запасания энергии. Известно, что на создание градиентов затачивается энергия АТФ, например работа К/Na-АТФ-азы. При подстановке результатов, полученных при измерении, в уравнение можно получить результаты приведенные ниже.

Эта общая протонодвижущая сила в 0,224 В соответствует свободной энергии 5,2 ккал в расчете на 1 моль протонов. Следовательно для синтеза одного моля АТФ необходим перенос 2 моль протонов.

2. При создании градиента рН в митохондриях или хлоропластах в них происходит синтез АТР в отсутствие переноса электронов.

3. Белок пурпурных мембран галобактерий при освещении перекачивает протоны. Синтетические пузырьки, содержащие этот бактериальный белок и очищенную АТР-азу из митохондрий сердца крупного рогатого скота, синтезируют АТФ при освещении. В этом опыте белок пурпурных мембран заменяет дыхательную цепь; следовательно, дыхательная цепь и АТФ-аза – биохимически отдельные системы, связываемые только протонным градиентом.

4. И дыхательная цепь, и АТФ-аза имеют векторную организацию во внутренней митохондриальной мембране.

5. Для окислительного фосфорилирования существенное значение имеет замкнутость компартментов. В растворимых препаратах или в мембранных фрагментах, лишенных хорошо отграниченных внутренних и внешних компартментов, не происходит синтеза АТФ, сопряженного с переносом электронов.

6. Вещества, переносящие протоны через внутреннюю митохондриальную мембрану, разрушают протонный градиент и таким образом вызывают разобщение окисления и фосфорилирования.

7. Компоненты дыхательной цепи уложены в мембране упорядоченно, «бок о бок», поперек мембраны, как предусматривается хемиосмотической теорией.

Второй важный факт это точки переноса протонов, или точки генерации протонного градиента, так как естественно, что в каждой реакции генерация не происходит. Следовательно важным моментом является определение количества и положения точек генерации протоннного градиента.

Механизмы генерации протонного градиента

Согласно хемиосмотической теории энергия окислительно-восстановительных реакций тратится на перенос протонов из матрикса митохондрии в межмембанное простанство. Но не все реакции в электронтранспортной цепи вызывают перенос протонов. Эти реакции выявлялись несколькими методами.

1. Соотношение Р/О при окислении нескольких субстратов.

В данном случае изучают соотношение фосфата, перешедшего в состав органичеких соединений к поглощенному кислороду. Для этого измеряют концентрацию свободного фосфата в среде с митохондириями до добавления субстрата, а затем после. Полученная разность концентраций является количеством фосфата, который перешел из свободного в связанное состояние, то есть был затрачен на синтез АТФ из АДФ и фосфата. Второй параметр – это поглощенный кислород. Измеряем концентрацию кислорода в начале и в конце опыта, разность равна количеству кислорода превратившемуся в воду в ходе работы электронтранспортной цепи. Делим разность концентраций свободного фосфата в среде на разность содержания кислорода и получаем соотношение P/O. Это значение различается для разных субстратов добавленных в оытную смесь с митхондриями.

Конец ознакомительного фрагмента.