Антибиотики и химиотерапевтические препараты. 3 Выделение продуцентов антибиотических веществ и методы определения их биологического действия (А. Н. Сизенцов, 2012)

После того как микроорганизм, обладающий ценными антибиотическими свойствами, тем или иным способом выделен из субстрата, необходимо определить принадлежность этого организма к определенному виду. Следовательно, исследователи должны владеть методами идентификации микроорганизмовпродуцентов антибиотиков. Известно, что определение видовой принадлежности микроорганизмов задача нелегкая, требующая больших навыков и умения.

При определении вида микроорганизма-продуцента антибиотического вещества используется большой комплекс признаков. В первую очередь используются признаки, легко наблюдаемые при культивировании организмов визуально или с помощью микроскопа, такие как морфологические (форма колоний на твердых средах, форма и размеры клеток, спор и спороносцев, характер спорообразования, наличие жгутиков, капсул или слизи вокруг клеток и другие признаки) и культуральные (характер роста организма на различных средах, наличие или отсутствие окраски субстрата и самих клеток, развитие в аэробных или анаэробных условиях, температурный оптимум развития и т.д.) признаки.

Однако установлено, что морфологических и культуральных признаков микроорганизмов часто бывает недостаточно для определения вида микроорганизма. Тем более это трудно сделать в группах микробов, близко стоящих друг к другу в родовом отношении.

Поэтому наряду с морфологическими и культуральными признаками для идентификации выделенных микроорганизмов используют и другие признаки. К их числу относятся физиологические и биохимические особенности организмов.

Под физиологическими свойствами микроорганизмов необходимо иметь в виду биохимическую сущность и биологическое значение тех процессов, которые совершаются в культуре, а не простую констатацию явлений (например, разжижение желатины, пептонизация молока и т.п.), которые иногда обнаруживаются на случайно взятых и часто неизвестных по составу средах.

К биохимическим особенностям микроорганизма относятся характер и пути превращения компонентов субстрата с образованием типичных для данного вида продуктов обмена (кислот, спиртов, пигментов, витаминов, антибиотиков, аминокислот и др.), типичные реакции метаболизма, характеризующие биосинтетические процессы в клетке, последовательность оснований нуклеиновых кислот, специфичная для разных видов организмов, а также другие признаки.

В последнее время все чаще и чаще для определения видов используют серологические реакции, которые весьма специфичны и позволяют дифференцировать виды, близко стоящие друг к другу. Реакции агглютинации и преципитации находят применение для идентификации не только бактериальных организмов, но и актиномицетов.

Для дифференциации видов бактерий и актиномицетов с успехом используют бактериофаги и актинофаги. Для распознавания видов актиномицетов лучшими признаны актинофаги, выделенные из лизогенных культур актиномицетов. Обычно такие фаги оказываются более специфичными по характеру и спектру их действия.

Однако при использовании актинофагов для дифференцирования видов следует иметь в виду и те трудности, которые обнаруживаются при этом. Необходимо помнить, что среди актиномицетов нередко встречаются штаммы, устойчивые к фагам, а среди актинофагов имеются и полифаги, лизирующие клетки многих видов актиномицетов. Все это свидетельствует о том, что использование фагов для идентификации видов может иметь лишь вспомогательное значение, т.е. служить дополнительным признаком.

3.3.1 Идентификации видов актиномицетов-антагонистов

Определенное значение при идентификации видов актиномицетовантагонистов, принадлежащих к одной группе, имеет метод, основанный на специфическом действии микробов-антагонистов. Специфичность действия микробов-антагонистов состоит в том, что, например, продуценты стрептомицина, выделенные из различных районов земного шара, не подавляют развитие друг друга. Такая закономерность характерна и для других видов актиномицетов.

Исходя из этого, предложено для идентификации внешне сходных культур актиномицетов применять метод так называемого перекрестного антагонизма.

Перекрестный антагонизм. Метода основан на том, что агаровые блочки с одним видом выращенного актиномицета помещают на поверхность агаровой пластинки, засеянной другим видом актиномицета. В качестве тесткультуры используется тот же штамм организма. При этом обнаруживается, что один вид актиномицета-антагониста подавляет рост других видов актиномицетов и не подавляет развитие своего вида (таблице 1).

Таблица 1 – Перекрестный антагонизм у некоторых видов актиномицетов (по Красильникову, 1951)

Метод специфики межвидового антагонизма может быть использован лишь при идентификации внешне очень близких видов актиномицетов и, повидимому, не может оказать существенной помощи при систематике далеко стоящих видов. Однако необходимо иметь в виду, что при перекрестном антагонизме изучаемый штамм актиномицета иногда не подавляет роста других известных видов, но он может не принадлежать ни к одному из этих видов. Так, Str.griseus не подавляет роста Str.rimosus, хотя это совершенно различные виды. Или в присутствии Sir.lavendulae не происходит подавления развития Sir.griseus (таблица 2).

Таблица 2 – Явление перекрестного антагонизма между отдельными видами актиномицетов (по Teillon, 1951)

При использовании метода перекрестного антагонизма следует иметь в виду также возможность самоугнетения, которое иногда имеет место среди некоторых штаммов актиномицетов. Культура Str.lavendulae штамм 2335 выделяет вещества, вызывающие самоугнетение, напоминающее действие лизинов. Вокруг агаровых блочков этой культуры образуются зоны отсутствия роста Str.lavendulae. Природа этих веществ пока неизвестна.

Оценивая все случаи, которые могут иметь место при использовании метода перекрестного антагонизма, следует заметить, что данный метод не помогает решению вопроса идентификации видов, но может оказать большую помощь при подразделении на виды культур внутри отдельных групп актиномицетов. Широкое применение при идентификации микроорганизмовпродуцентов антибиотиков нашли и другие методы.

Использование форм организмов, устойчивых к определенному антибиотическому веществу. В основу этого метода положены два основных признака, связанных с образованием и действием антибиотиков.

1. Каждый антибиотик образуется одним или несколькими определенными видами микробов.

2. Микроорганизмы, устойчивые к определенному антибиотику, устойчивы также к антибиотическим веществам, близким по химическому строению и биологическим свойствам к первому антибиотику. Вместе с тем они могут обладать чувствительностью к антибиотикам, имеющим другую химическую природу и, следовательно, другое биологическое действие.

Определение антибиотика, образуемого неизвестным организмом, может быть проведено путем испытания его биологического действия на ряд микроорганизмов, чувствительных и устойчивых к известным антибиотикам. Таким путем можно выяснить сходство или различие биологического действия изучаемого вещества и известных антибиотиков и тем самым решить вопрос о химическом сходстве или различии этих веществ.

Для исследования этого явления изучаемый организм высевают на поверхность питательного агара в виде штриха или в виде отдельной макроколонии в центре чашки Петри. Образуемое организмом антибиологическое вещество диффундирует в окружающий агар и создает определенную зону. Пересекая эту зону чувствительными и устойчивыми к определенному антибиотику микроорганизмами, можно выяснить сходство биологического действия изучаемого препарата с известным антибиотиком. Установив сходство биологического действия исследуемого вещества с известным антибиотиком, можно предположить, что изучаемое соединение относится к определенной группе антибиотических веществ и образуется соответствующими организмами.

Однако следует иметь в виду, что оценка принадлежности изучаемого организма к тому или иному виду продуцентов может быть лишь ориентировочной. Так, было известно, что b-лактамные антибиотики образуются только плесневыми грибами, но последующие исследования показали, что антибиотические вещества этой природы образуют некоторые виды стрептомицетов и собственно бактерий.

Метод хроматографии Хорошим методом для идентификации антибиотиков и их продуцентов является метод хроматографии, открытый выдающимся русским ученым Цветом еще в 1903 г. и теперь очень широко используемый в лабораторной практике. Метод широко применяется при идентификации антибиотиков на ранних стадиях исследования, что имеет весьма важное значение. Определение антибиотика на ранних стадиях работы может значительно сократить время его изучения. Иногда метод хроматографии бывает необходимо дополнить данными методов электрофореза, которые помогают выяснить прежде всего ионный характер антибиотика.

Метод бумажной хроматографии антибиотиков состоит в следующем. На полоски хроматографической бумаги длиной 20-30 см и шириной в 1 см наносится испытуемый антибиотик. Подсушенные на воздухе полоски хроматографической бумаги с нанесенным антибиотиком помещают затем в хроматографический бак или цилиндр с соответствующим растворителем на 10-20 ч. Время выбирается в зависимости от скорости прохождения растворителя и от высоты используемого сосуда для хроматографии.

Для обнаружения антибиотиков па хроматограммах могут применяться биологические, химические и физические методы.

Наиболее распространенным методом обнаружения антибиотиков на хроматограммах является биоавтографический метод. С этой целью высушенные в вытяжном шкафу полоски бумаги накладываются на агаровую пластинку, предварительно засеянную культурой тест-организма, чувствительной к изучаемому антибиотику. Кюветы с полосками бумаги помещают в термостат на 18-20 ч при температуре, оптимальной для роста тест-организма. По зонам отсутствия роста тест-микроба, образующимся вокруг тех мест на хроматограмме, где находится пятно антибиотика, судят, во-первых, об однородности антибиотика; во-вторых, сравнивают полученные хроматограммы с хроматограммами известных антибиотических веществ (рисунок 1).

а – стандартный раствор пенициллина G; б, в – хроматограмма производственных образцов 1950 г. За пятном пенициллина G (вверху) следуют пенициллин F, дигидро F и самая нижняя зона – пенициллин К; г – хроматограмма конечного препарата калиевой соли (1950).

Рисунок 1 – Использование метода бумажной хроматографии для разделения пенициллинов, образуемых штаммом Q-176 на кукурузной среде с лактозой

Химические методы обнаружения антибиотиков на хроматограммах основаны на реакциях, в результате которых образуются соединения, выявляемые по соответствующей окраске или обесцвечиванию реактива в месте расположения пятна антибиотика.

Физические методы обнаружения антибиотиков включают в себя способы, связанные:

а) с выявлением люминесценции антибиотического пятна в ультрафиолетовом (УФ) возбуждении;

б) с поглощением УФ излучения;

в) с определением радиоактивной метки антибиотика.

Для целей бумажной хроматографии антибиотиков с успехом можно использовать и круговые хроматограммы.

Важное значение при оценке результатов хроматографии имеет положение пятен исследуемых веществ, характеризуемое коэффициентом R_f. Коэффициент R_f определяется отношением расстояния, которое проходит пятно изучаемого вещества от линии старта за определенное время, к расстоянию фронта растворителя, прошедшего от линии старта:

где Sp – расстояние, пройденное пятном изучаемого вещества;

Sf – расстояние фронта растворителя, пройденное от старта.

Воспроизводимость значении R_f зависит от постоянства следующих факторов: качества бумаги, температуры, степени чистоты растворителей, состава газов атмосферы, в которую помещена бумага, однотипности процедур и аппаратуры.

При использовании метода хроматографии па бумаге для идентификации антибиотиков было показано, что значение R_f зависит также и от системы растворителей, от степени очистки изучаемого антибиотика и от состава культуральной жидкости.

По спектру значении R_f или, как его иногда называют, по хроматографическому спектру можно четко различать группы химически родственных антибиотиков и до некоторой степени отличать также антибиотики внутри групп.

Существенное значение при использовании бумажной хроматографии для идентификации антибиотиков имеет разработка методов, позволяющих проводить эти исследования на ранних этапах изучения антибиотических веществ, т.е. на стадии культуральных жидкостей. Однако при этом встречаются большие затруднения в разгонке антибиотиков, так как факторы, оказывающие влияние на значение R_f, часто встречаются при использовании культуральных жидкостей.

Преодолеть эти затруднения удалось с помощью методов лиофилизации фильтратов культуральных жидкостей и экстрагирования их соответствующими растворителями. Сущность схемы хроматографической идентификации антибиотиков из культур на стадии малоактивных культуральных жидкостей состоит в следующем. Культуральную жидкость, обладающую антибиотическими свойствами, фильтруют и измеряют рН. Точно взятый объем фильтрата подвергают лиофильной сушке, затем лиофилизат взвешивают и разделяют на две части, одну из которых растворяют в воде, а другую экстрагируют безводным этанолом при встряхивании в течение часа. Растворители берут в таком количестве, которое, как правило, позволяет получить 5-10-кратные концентрации по сравнению с исходной культуральной жидкостью. Антибиотическую активность водного раствора и спиртового экстракта определяют методом бумажных дисков.

В случае если спиртовой экстракт обладает антибиотической активностью, схожей с активностью водного раствора лиофилизата, то проводят хроматографирование в соответствующей системе. Хроматограммы проявляют биоавтографически на чашках с Bacillus subtilis. Одновременно производят электрофорез в ацетатном и фосфатном буферах.

Если для изучаемого антибиотика во всех системах 1-го типа значение R_f будет около 0,8 и выше, то спиртовой экстракт хроматографируют в другой системе. При помощи набора этой системы можно наиболее уверенно отличить антибиотики типа эритромицина и олеандомицина, типа карбомицина, типа актиномицина и хлорамфеникола.

Полученные данные позволяют в определенной степени идентифицировать антибиотик или включить его в определенную группу химически близких веществ, или, наконец, определить его как новый антибиотик.

Пути выделения продуцентов антибиотических веществ из естественных мест их обитания и их первичной идентификации представлено на схеме (рисунок 2).

Рисунок 2 – Схема выделения актиномицетов – продуцентов антибиотиков (по Коневу, 1981)

Если в результате проведенной работы по идентификации выделенного микроорганизма установлено, что он является новым видом, и антибиотическое вещество, образуемое им, не принадлежит к уже описанным соединениям, то и организм и антибиотик должны быть подвергнуты детальному исследованию. С этой целью, прежде всего, изучаются условия культивирования микроба, обеспечивающие максимальное образование антибиотика.

При подборе сред необходимо иметь в виду, что чем сложнее среда, тем труднее производить выделение и очистку антибиотика, поэтому среда для культивирования должна быть по возможности простой по составу и обеспечивать максимальное образование антибиотического вещества.

Выделение антибиотиков и их очистка осуществляются разными способами, выбор которых зависит от химической природы антибиотика, характера сопутствующих антибиотику продуктов жизнедеятельности организма (органические кислоты, аминокислоты, пигменты и другие соединения), неиспользованных компонентов среды (углеводы, масла, азотсодержащие вещества, неорганические соли и др.), а также от того, где накапливается это вещество – в культуральной жидкости или в клетках продуцента. Основная задача первых этапов выделения антибиотического вещества – концентрирование биологически активного соединения и очистка от сопутствующих балластных веществ.

Основными методами выделения антибиотиков из нативных растворов (культуральная жидкость, освобожденная от биологической массы продуцента) можно назвать следующие: осаждение антибиотика, методы экстракции антибиотиков органическими растворителями, сорбционные методы с использованием поверхностно-активных веществ (активированный уголь, активированный оксид алюминия и др.) или ионообменных материалов (ионообменные смолы). При применении сорбционных методов выделения антибиотиков наиболее трудной задачей является десорбция (элюирование) препарата.

Антибиотик, выделенный одним из указанных способов, представляет собой лишь технически чистый препарат, который не может еще использоваться в медицинской практике. Дальнейшая очистка препарата осуществляется или путем повторной сорбции, перекристаллизации, растворением антибиотика в органических растворителях, или иными методами.

3.4.1 Антимикробный спектр и токсичность

После того как антибиотическое вещество с помощью того или иного метода выделено и хорошо очищено, проверяют его биологическую активность по отношению к широкому ряду микроорганизмов (проверяют широкий антимикробный спектр). Кроме того, антибиотик исследуют на стерильность, токсичность, пирогенность, испытывают в отношении действия на лейкоциты крови и определяют другие показатели.

Выяснение стерильности готового препарата необходимо для установление отсутствия в нем спор микроорганизмов, прежде всего патогенных. Для этого необходимо, если это возможно, инактивировать антибиотические вещества, а затем произвести посев его на разнообразные по составу питательные среды (мясопептонный бульон, печеночный бульон, кровяной агар и т.п.).

Инактивацию пенициллина осуществляют с помощью фермента пенициллиназы (пенициллин-b-лактамазы), или солянокислым гидроксиламином.

Стрептомицин инактивируют при помощи гидроксиламина или цистеина. Многие антибиотики не удается инактивировать, поэтому их стерильность определяют лишь в отношении форм микроорганизмов, устойчивых к этим антибиотикам.

Токсичность антибиотика определяют на экспериментальных животных, которым в течение определенного периода времени внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно или иными путями вводят различные дозы изучаемого антибиотика. За такими животными ведут тщательные наблюдения. При отсутствии внешних изменений в поведении животных в течение 12-15 суток считают, что испытуемый антибиотик не обладает заметными токсическими свойствами. Это, разумеется, первый и предварительный этап в изучении токсичности антибиотика.

При более глубоком исследовании этого вопроса выясняется влияние препарата на отдельные ткани и органы животных. Некоторые антибиотики обладают кумулятивной токсичностью, проявляющейся в том, что его токсические свойства при введении в организм изо дня в день накапливаются, не обнаруживая каких-либо внешних проявлений, но в итоге приводят организм к гибели. Это скрытая токсичность, которая противоположна острой, вполне четкой токсичности препарата, проявляющейся сразу же после первого введения антибиотика.

Отсутствие местной и общей токсичности антибиотика, отсутствие пирогенности и угнетения деятельности лейкоцитов, сохранение антибиотической активности препарата в присутствии сыворотки крови, гноя и других веществ, необходимый спектр антимикробного действия дают основание проводить дальнейшие испытания изучаемого препарата как лечебного вещества.

Вместе с этим необходимо определить характер биологического действия антибиотика, иными словами, выяснить, является ли антибиотик бактериостатическим или бактерицидным. Знание характера действия препарата может создать определенное представление о механизме его антибактериальных свойств.

3.4.2 Лечебные свойства антибиотиков

Следующий этап изучения антибиотика это определение его фармакологических и терапевтических свойств. Лечебные свойства антибиотиков проверяют на экспериментальных животных, зараженных соответствующей дозой определенного вида патогенного микроба. Обычно используют дозы инфекции с таким расчетом, чтобы вызвать гибель 50 % животных (LD50) и гибель 100 % животных (LDl00).

LD50 – минимальная смертельная доза. Животных делят на 3 группы. Одной группе животных антибиотик вводят сразу же после заражения; вторая группа животных подвергается обработке антибиотиком через некоторое время после заражения (через 5 ч или позже). Во всех случаях применяют такие максимальные дозы антибиотика, которые переносятся животными. Третья группа подопытных животных не подвергается обработке антибиотиком – это контроль.

По количеству выживших, особенно в опытных группах, судят о терапевтической ценности изучаемого антибиотического вещества. Минимальное количество антибиотика, способствующее предохранению животного от смертельной дозы инфекции, составляет минимальную терапевтическую дозу.

Отдельные антибиотические вещества, имеющие лечебные свойства, проявляют вместе с тем в определенных концентрациях токсичность по отношению к макроорганизму. Если лечебная доза антибиотика ниже токсичной, то такой препарат может быть использован в медицинской практике. Если терапевтическая доза равна токсичной или приближается к ней, то широкое применение такого антибиотика в лечебной практике не разрешается. Часто изучаемый антибиотик по тем или иным причинам не может быть использован в медицинской практике, тогда его следует испытать в сельскохозяйственном производстве или в отдельных отраслях пищевой и консервной промышленности.

Только после всестороннего и глубокого изучения антибиотика можно говорить о перспективности или, наоборот, о непригодности его для практических целей.

3.4.3 Лабораторный регламент

Антибиотическое вещество, имеющее практическую значимость и являющееся новым препаратом, должно выпускаться в промышленных масштабах. Поэтому при изучении продуцента и образуемого им антибиотика в лабораторных условиях разрабатывается так называемый лабораторный регламент.

Лабораторный регламент – это технологический документ, которым завершаются научные исследования в лабораторных условиях по разработке метода получения антибиотика. Он служит основой для разработки промышленного регламента. Задача лабораторного регламента – разработка оптимального метода производства антибиотического вещества. Лабораторный регламент получения антибиотика должен включать следующие разделы:

1 Характеристика антибиотика. Отражает название антибиотика, основное назначение, краткое описание свойств препарата, описание организма, образующего антибиотик, методы определения биологической активности, условия хранения.

2 Технологическая схема производства. В схеме указывается последовательность работ по производству антибиотика с подразделением на стадии. Технологическая схема – основа будущей технологии промышленного получения препарата.

3 Сырье и материалы. Сообщаются требования, предъявляемые к качеству сырья и материалам, используемым при получении антибиотика с целью его максимального выхода и обеспечения повторяемости результатов. При этом необходимо ориентироваться на сырье и материалы, выпускаемые отечественной промышленностью.

4 Аппаратурная схема производства. Приводится схема процесса получения антибиотика с указанием аппаратов и приборов, их конструкции, размера и других характеристик, которые могут иметь значение при производстве антибиотика.

5 Изложение технологического процесса. Включая описание процесса получения антибиотика на основе завершенных научных и экспериментальных результатов, выполненных в лабораторных условиях. Процесс включается в регламент в том случае, если удается получить воспроизводимые результаты по качеству антибиотика и его выходу. Технологический процесс описывают по стадиям, подробно указываются объемы, концентрации веществ, входящих в среду, рН среды, степень аэрации, растворители, пеногасители, условия перемешивания, продолжительность процесса развития продуцента, температура и другие показатели.

6 Отходы производства, технологические и вентиляционные выбросы в атмосферу, их использование и обезвреживание. Приводится перечень возможных отходов и выбросов в атмосферу, наличие в отходах ценных веществ и рекомендации по их использованию, наличие веществ, вредных с точки зрения загрязнения окружающей среды, и способы их обезвреживания.

7 Контроль производства. Указываются особые требования к оборудованию (герметичность ферментера и всех коммуникаций, исправность и надежность работы мешалки и т.д.), анализ качества сырья, соответствующего определенным стандартам, режимы стерилизации сред и отдельных веществ, воздуха, методы анализа процесса биосинтеза антибиотика и готовой продукции.

8 Техника безопасности, пожарная безопасность и производственная санитария. Приводится перечень веществ, способных воспламеняться и взрываться. Все вещества, применяемые в процессе получения антибиотика, должны быть изучены с позиций техники безопасности, пожарной безопасности и производственной санитарии.

9 Перечень производственных инструкций. Приводятся все инструкции, которые должны быть разработаны на основе лабораторного регламента.

10 Технико-экономические нормативы. Указываются выходы конечного продукта и промежуточных продуктов; удельные нормы расхода сырья и материалов, удельные нормы расхода технологических энергозатрат (пара, воды, электроэнергии, сжатого воздуха).

11 «Информационные материалы». В разделе указываются биологические и физико-химические свойства вещества, степень их очистки, фармакологические свойства (преимущества и особенности), сравнение с показателями идентичных зарубежных препаратов, сведения о патентной чистоте антибиотика и методе его получения с перечислением охраняющих авторских свидетельств (патентов), сведения о вредности веществ, применяемых при получении препарата, и мерах предосторожности при работе с ними.

Микроорганизмы-продуценты антибиотиков, выделенные из природных субстратов, обычно обладают низкой антибиотической активностью. Так, например, различные штаммы Penicillium, выделенные из почв, образуют пенициллин при глубинном их выращивании в количестве от 10 Ед/мл до 30 Ед/мл культуральной жидкости. Продуцент стрептомицина Str.griseus, впервые выделенный Ваксманом с сотрудниками в 1944 г. из сильно унавоженной почвы, образовывал до 100 мкг/мл стрептомицина.

Понятно, что потребности медицины, сельского хозяйства и некоторых отраслей промышленности не могут быть удовлетворены без получения наиболее продуктивных штаммов организмов, образующих антибиотические вещества.

Поэтому перед наукой поставлена задача разработки путей повышения биосинтеза практически ценных антибиотических веществ. При решении этой задачи необходимо применять два тесно связанных метода: селекцию наиболее активных форм продуцентов антибиотиков и изучение условий культивирования полученных вариантов с целью определения наиболее оптимальной биосинтетической активности.

3.5.1 Селекция наиболее активных форм продуцентов антибиотиков

В селекционной работе по получению активных продуцентов антибиотических веществ используют различные приемы, в основе которых лежат методы и законы генетики.

Прежде всего, при изучении вновь выделенных микроорганизмовпродуцентов антибиотиков стремятся отобрать наиболее активные варианты, имеющиеся в культуре.

Микроорганизмы обладают естественной изменчивостью, т.е. среди клеток или спор одного и того же штамма могут обнаружиться формы, отличающиеся по морфологическим или биохимическим, в том числе и по антибиотическим признакам. Остановимся на разборе метода отбора наиболее активных антибиотикообразующих вариантов микроба.

Продуцент антибиотика высевают на пластинку питательного агара в чашке Петри с таким расчетом, чтобы получить на ней развитие не более 40-50 изолированных колоний. После достаточно хорошего развития колоний проверяют их способность к образованию антибиотика (в основном двумя методами).

Первый метод . Выросшие колонии заливают расплавленным и охлажденным до 55 °C питательным агаром, содержащим тест-организм, чувствительный к изучаемому антибиотику. Затем чашки помещают на 20-24 ч в термостат при температуре, оптимальной для развития тест-культуры. За это время вокруг колоний образуются зоны отсутствия роста тест-организма. Размеры диаметра зон отсутствия роста вокруг колоний микроорганизма бывают различными. Чем больше колония образует антибиотика, тем большей будет зона отсутствия роста тест-организма. Такие наиболее активные колонии легко обнаружить (рисунок 3).

1 – питательный агар с тест-организмом; 2 – питательный агар для развития колоний продуцента антибиотика; 3 – колония; 4 – зона диффузии антибиотика.

Рисунок 3 – Схема опыта по определению антибиотической активности колоний микроорганизмов методом заливки их питательным агаром, содержащим тест организмы

Для выявления изменчивости, связанный с образованием антибиотиков у бактериальных организмов (споровых), на колонии перед заливкой расплавленного агара можно помещать стерильные диски фильтровальной бумаги, диаметр которых равен внутреннему диаметру чашки Петри. Таким диском фильтровальной бумаги прикрываются выросшие колонии бактерий, а расплавленный агар наливается на поверхность бумажного диска. Это облегчает последующее выделение наиболее активной колонии в чистом виде.

При селекции наиболее активных штаммов продуцентов ряда антибиотиков, выделенных из естественных мест их обитания, используют антибиотики. Например, для выделения из почвы наиболее активных штаммов продуцента стрептомицина в агаровую среду, используемую для их высева, добавляют определенную концентрацию стрептомицина. Штаммы Str.griseus, образующие большие количества антибиотика, способны выдерживать такую концентрацию стрептомицина и нормально развиваться в его присутствии. Менее активные штаммы не приспособлены к высоким концентрациям стрептомицина и в его присутствии не развиваются.

В питательную агаровую среду вносят стрептомицин в количестве 100 мкг/мл субстрата, а затем высевают выделенные штаммы актиномицетов, относящиеся к Sir.griseus. В результате культуры, чувствительные к этой концентрации стрептомицина, не давали развития примерно в 80 % случаев. Остальные 20 % штаммов, среди которых были и довольно активные, вырастали на этой среде. Приведенный метод оказывается полезным при первичном исследования почвенных культур актиномицетов.

Однако методы выделения наиболее активных форм, получающихся в результате естественной изменчивости, не дают значительного повышения образования антибиотиков.

Решающим приемом, обеспечивающим успех селекции многих продуцентов антибиотиков, является метод получения мутаций под влиянием сильнодействующих факторов – рентгеновских и ультрафиолетовых излучений, некоторых химических соединений (азотистой формы иприта др.). При действии таких факторов в течение определенного периода времени происходит полная гибель микроорганизмов. Однако можно подобрать экспозицию (концентрацию) и силу воздействия, при которых часть клеток или спор изучаемого вида может выжить.

У таких переживших микроорганизмов особенно под влиянием сильнодействующих факторов, могут появляться формы с измененным характером отдельных звеньев обмена веществ, а так же варианты с измененными свойствами. Наряду с формами, потерявшими способность образовывать антибиотик, а их обычно бывает большинство, появляются такие, у которых обнаруживается значительное повышение антибиотикообразования.

Выявление высокоактивных штаммов осуществляется теми же методами, которые используются и при отборе вариантов, возникающих в результате естественной изменчивости.

Довольно часто в селекционной работе применяют последовательное воздействие на организм различных факторов. В результате применения различных методов селекции удалось значительно (от 50 до 100 и более раз) увеличить образование таких важных антибиотиков, как пенициллин, стрептомицин, антибиотики тетрациклиновой группы и др. (таблица 3).

Таблица 3 – Результат селекции продуцентов некоторых антибиотиков (по Захарову и Квитко, 1967)

Существенное значение в селекционно-генетической работе имеет выход образующихся мутации, который зависит от применяемого мутагена, его концентрации, времени воздействия, а также от свойств самого организма. При селекции наиболее активных штаммов продуцентов антибиотиков необходимо иметь в виду, что частота морфологических мутации микроорганизмов не всегда совпадает с частотой биосинтетических мутаций.

Иногда при селекции продуцентов антибиотиков, относящихся к плесневым грибам, используют анастомозные культуры, т.е. культуры, полученные в результате соединения двух развивающихся конидий перемычками, анастомозами. Образовавшиеся таким образом гибридные формы продуцента пенициллина при действии на них ультрафиолетовых излучений или этиленимина дают большую частому изменчивости.

В результате использования анастомозных штаммов гриба Реnicillium и при обработке их ультрафиолетовым излучением или этиленимином был получен вариант «новый гибрид», образующий в соответствующих условиях культивирования до 5000 единиц пенициллина.

Селекцию актиномицетов-продуцентов антибиотиков проводят, преследуя разные цели. Так, при селекции продуцента стрептомицина необходимо было получить штамм с высокими биосинтетическими свойствами и как можно меньшей способностью к образованию маннозидострептомицина, значительно снижающего биологическую активность стрептомицина в пересчете на единицу биомассы (мг).

Для получения высокоактивных штаммов продуцентов стрептомицина были использованы различные воздействия на актиномицет. Вначале исходная культура, образующая до 200 мкг/мл стрептомицина, пересевалась на среды, содержащие постепенно увеличивающиеся дозы стрептомицина. Удалось получить штамм, адаптированный к 400 мкг/мл антибиотика. Затем взвесь спор актиномицета в дистиллированной воде подвергалась облучению ультрафиолетовым и рентгеновским излучениями в экспозиции, при которой гибель спор составляла 99 %. Облученная суспензия с 1 % выживших спор высевалась на чашки, и каждая выросшая при этом колония изучалась на образование стрептомицина. В результате этого был выделен вариант актиномицета, образующий до 2000 мкг/мл стрептомицина (таблица 4).

Таблица – 4 Схема селекции высокопродуктивного штамма продуцента стрептомицина (по Dylaney, 1953)

Необходимо отметить, что селекция продуцента стрептомицина более сложна. Хорошие результаты получаются при многократном облучении актиномицета ультрафиолетовым излучением при высокой плотности облучения, доходящей до 10000-20000 эрг/мм² (летальные дозы). Для повышения выживаемости облученных спор применяется выдержка их на видимом свете. В итоге работ по селекции продуцента стрептомицина удалось получить штаммы, способные образовывать до 6000 мкг стрептомицина в 1 мл среды. В настоящее время получены штаммы продуцентов стрептомицина, пенициллина, тетрациклинов, эритромицина и других антибиотиков, в несколько раз более продуктивные (иногда на порядок выше), чем это было, например, 20 лет назад.

В последние годы при создании новых высокопродуктивных штаммов микроорганизмов используется ряд новых приемов, в их числе конъюгация плазмидами, слияние протопластов (даже межвидовых), трансформация хромосомных генов и др. Метод слияния протопластов позволяет получать гибриды промышленных штаммов стрептомицетов, а облучение клеток донора и реципиента дает в этом случае увеличение частоты рекомбинаций. Трансформация протопластов хромосомальной ДНК возможна лишь в том случае, если протопласты заключены в липосомы; при этом методе также возрастает частота рекомбинантов.

Таким образом, при использовании различных методов селекции имеется возможность значительно повысить биосинтез ценных антибиотических веществ, образуемых плесенями, актиномицетами и бактериями.

Не менее важную роль в увеличении выхода антибиотиков играют условия культивирования – состав среды, аэрация, температура и др. Так, подбор оптимальной среды для каждого полученного в процессе селекции варианта иногда дает возможность увеличить выход антибиотика в 3 и более раза.

Обычно с выделением нового варианта продуцента антибиотика довольно резко меняется его потребность к условиям культивирования: условия аэрации среды, температура культивирования, удлиняется период процесса антибиотикообразования, могут меняться и другие параметры.

При получении нового варианта продуцента антибиотика важно выявить экономический эффект от внедрения его в практику. Иногда увеличение выхода антибиотика от 10 % до 20 % может оказаться экономически невыгодным, если изменившиеся условия культивирования потребуют применения более дорогой среды или более жестких условий регулирования процесса. Следовательно, для увеличения выхода нужных антибиотиков существенную роль играют: селекция наиболее активных штаммов и изучение условий их культивирования.

3.6.1 Сохранение штаммов продуцентов антибиотиков в активном состоянии

Важное значение для промышленного получения антибиотиков, а также для лабораторных исследований продуцентов антибиотических веществ имеют методы поддержания жизнеспособности организмов, позволяющие сохранить их антибиотическую активность на постоянном уровне.

Известно, что микроорганизмы и в особенности актиномицеты легко изменяются при обычных методах их хранения. Причем довольно часто при этом наблюдается полная или частичная потеря антибиотических свойств.

Потеря антибиотических свойств зависит, по-видимому, от того, что мы не умеем в обычных условиях культивирования создать такие условия, которые бы способствовали сохранению организмом его основных физиологических особенностей. Нередко потеря активности наблюдается при культивировании микроорганизмов на богатых по составу средах и при частых пересевах.

Вместе с тем изменение физиологических или биохимических свойств продуцентов антибиотических веществ может определяться их генетическими закономерностями. Известно, например, что продуцент грамицидина С в процессе развития диссоциирует на ряд вариантов, некоторые из которых не образуют этот антибиотик. Причем процесс диссоциации культуры идет в направлении образования в большом количестве биологически неактивных вариантов, что в конечном итоге приводит к полной потере культурой способности образования грамицидина С.

В настоящее время используется ряд методов сохранения культур продуцентов антибиотиков, обеспечивающий их длительное пребывание в активном состоянии. В основу этих методов положен принцип задержки развития микроорганизмов (принцип консервации). Для каждого вида продуцента антибиотических веществ должен быть подобран свой, наиболее подходящий метод консервирования, позволяющий сохранить культуры в активном состоянии в течение относительно длительного времени.

Наиболее распространенными методами сохранения культур микроорганизмов-продуцентов антибиотиков в активном состоянии являются следующие:

1) лиофилизация культур;

2) хранение вегетативных клеток или спор организмов в стерильной почве, стерильном песке или на семенах некоторых растений (например, просе). По данным ряда авторов, культуры актиномицетов, находящихся в стерильной почве, сохраняют жизнеспособность в течение 30 лет и более;

3) хранение спор в виде водных суспензий в запаянных ампулах;

4) хранение спор в стерильном кварцевом песке;

5) хранение культур на агаровом косячке под минеральным маслом;

6) хранение культур при низких температурах (4, 5 °С);

7) в последнее время для сохранения различных микроорганизмов в активном состоянии используют жидкий азот, в который помещают отмытую от среды суспензию клеток. Иногда в газообразной фазе жидкого азота сохраняют культуры актиномицетов, находящиеся на агаровых блочках, вырезанных из агаровой пластинки в чашках Петри.

Наилучшей формой сохранения организмов, при которой не наблюдается потери антибиотической активности, является их лиофилизация, данный метод пригоден как для спорообразующих, так и для бесспоровых культур микроорганизмов. Сущность этого метода состоит в том, что суспензия клеток или спор микроорганизма, приготовленная на среде богатой белками (часто используется для этих целей кровяная сыворотка), быстро замораживается при температуре от минус 40 °С до минус 60 °C и высушивается под вакуумом до остаточной влажности (от 0,5 % до 0,7 %). После такой обработки ампулы со спорами или клетками лиофилизированного микроба запаивают. Лиофилизированные формы бактерий могут сохраняться в течение 16-18 лет, споры грибов не теряют основных свойств при хранении их в лиофилизированном виде в течение 10 лет.

После того как микроб-антагонист выделен из естественного субстрата, его антибиотическую активность по отношению к различным тест-объектам определяют одним из существующих методов. При этом важно учитывать те факторы, которые влияют на образование антибиотиков. Изучение антибиотических свойств микроорганизмов осуществляют при их культивировании на твердых (агаризированных) или в жидких средах.

3.7.1 Методы определения антибиотической активности микроорганизмов, выросших на твердых питательных средах

Большинство методов определения антибиотической активности связано с культивированием изучаемого организма на агаризированных средах. Здесь мы остановимся лишь на наиболее распространенных методах выявления антибиотических свойств микробов.

Метод перпендикулярных штрихов . Испытуемый организм высевается штрихом (полоской) на поверхность агаровой пластинки чашки Петри. После того как микроорганизм разовьется, перпендикулярно его штриху подсеваются различные тест-организмы. Чашки помещаются в термостат на 20-24 ч. Если изучаемый организм оказывает антимикробное действие в отношении ряда тест-микробов, то последние будут расти вдали от штриха антагониста. Нечувствительные микробы будут развиваться в непосредственной близости от штриха изучаемого организма (рисунок 4).

Рисунок 4 – Метод перпендикулярных штрихов для определения антагонистических свойств микроорганизмов

Данный метод используется в практике поиска продуцентов антибиотических веществ, однако он имеет один существенный недостаток. При методе штриха используется одна и та же среда для культивирования изучаемого организма и для роста тест-микробов.

Например, если для образования антибиотика необходима среда с нитратным источником азота, то такая среда может быть совершенно непригодной для развития ряда тест-организмов. И наоборот, многие тест-организмы хорошо растут на среде, состоящей из бульона Хоттингера, но не все организмы могут продуцировать антибиотик на этой среде. В этом случае можно не определить антибиотическую активность организма, хотя он и обладает этой способностью.

Метод агаровых блочков. Изучаемый организм высевают сплошным «газоном» на поверхность агаровой пластинки в чашке Петри. Среда используется такая, которая благоприятна не только для роста организма, но, самое главное, для образования им антибиотика. Иногда целесообразно высевать организм на разные по составу среды.

После того как организм хорошо вырастет, пробочным сверлом (диаметр примерно 8 мм) вырезают агаровые блочки, которые переносят на поверхность другой агаровой пластинки, предварительно засеянной одним тест-организмом. На одну чашку Петри можно разместить 5-7 агаровых блочков (рисунок 5).

Рисунок 5 – Использование агаровых блочков с выросшей культурой микроба для определения ее антибиотических свойств

Чашки с агаровыми блочками помещают в термостат на 20-24 ч при температуре, благоприятной для развития тест-организма. Если выделяемый организмом антибиотик подавляет развитие тест-микроба, то вокруг агарового блочка образуется зона отсутствия роста. Чем больше выделяется антибиотика или чем активнее образуемое антибиотическое вещество, тем больше будет диаметр зоны отсутствия роста тест-микроба.

Метод высева антагониста на одной половине агаровой пластинки с последующим подсевом тест-микробов штрихами на другой половине агаровой пластинки . Чашка Петри разделяется стеклянной перегородкой пополам. В одну половину наливают питательный агар, благоприятный для развития изучаемого организма и образования антибиотика; другая половина чашки остается свободной. Иногда поступают иначе. В чашку Петри (без перегородки) наливают питательный агар, затем, когда агар застынет, стерильным скальпелем удаляют одну половину агаровой пластинки. На половину агаровой пластинки высевают сплошным «газоном» изучаемый организм, и засеянные чашки помещают в термостат для получения хорошего развития микроба (рисунок 6).

Рисунок 6 – Определение антибиотических свойств микроорганизмов, выросших на половине агаровой пластинки в чашке Петри

После этого на оставшуюся свободную часть пластинки в чашке наливают расплавленный питательный агар, пригодный для развития тест-организмов, которые высевают штрихами, перпендикулярными границе развития антагониста. Чашки вновь помещают в термостат на 20-24 ч при температуре, благоприятной для развития тест-организмов.

Чувствительные тест-микробы будут расти на определенном расстоянии от антагониста, устойчивые же формы развиваются на протяжении всего штриха.

Метод агарового блочка, находящегося в центре чашки Петри . Так же, как и в предыдущем методе, в чашке создаются благоприятные условия, как для развития антагониста, так и для развития тест-микроба (рисунок 7).

Рисунок 7 – Определение антибиотических свойств микроорганизмов методом агарового блочка, находящегося в центре чашки Петри (по Егорову, 1957)

В чашку Петри наливают питательный агар, пригодный для развития изучаемого организма с образованием антибиотического вещества, из расчета 2025 мл на стандартную чашку. В застывшем агаре стерильным пробочным сверлом (диаметр 20-22 мм) вырезают агаровые блочки, которые затем переносят в другие стерильные чашки Петри. В центр каждой чашки – помещают по одному такому блоку (рисунок 8 а), затем в эти же чашки на свободную их часть наливают питательный агар, пригодный для развития тест-микробов, с тем расчетом, чтобы уровень этого агара был на 1-1,5 мм ниже уровня блочка (рисунок 8 б). В случае изучения бактериальных организмов приготовленные таким способом чашки необходимо немного подсушить, с тем чтобы удалить конденсационную влагу.

а – помещение агарового блочка в центр стерильной чашки Петри; б – заливка чашки Петри стерильной агаризованной средой на 1,5 мм ниже уровня агарового блочка; 1 – агаровый блочек; 2 – агаровая среда, благоприятная для роста тест-организма.

Рисунок 8 – Схема приготовления чашек Петри для определения антибиотических свойств микроорганизмов, выросших на поверхности агарового блочка, находящегося в центре чашки (по Егорову, 1957)

После того как чашки подготовлены, изучаемый организм высевают микробиологической петлей на поверхность агарового блочка, и чашки помещают в термостат на срок, обеспечивающий нормальное развитие организма. Затем по радиусам агаровой пластинки высевают штрихами тест-организмы, и чашки вновь на 20-24 ч помещают в термостат.

Отсутствие роста штриха тест-микроба на том или ином расстоянии от блочка будет указывать на угнетение его антибиотическим веществом изучаемого организма. Если же штрих тест-микроба развивается в непосредственной близости от агарового блочка, то это означает, что данный организм устойчив к действию антибиотика изучаемого антагониста.

Для изучения актиномицетов рационально агаровые блочки того же диаметра вырезать из среды, на которой уже вырос актиномицет. Посев тестмикробов производят сразу же после внесения агаровой среды в чашку или же чашку предварительно помещают на 18-20 ч в термостат при 26-30 °C, с тем чтобы накопившийся в блочке антибиотик лучше продиффундировал в окружающий агар.

3.7.2 Определение антибиотической активности микроорганизмов при культивировании их в жидких питательных средах

При определении антибиотических свойств микроорганизмов, культивируемых в жидких средах, необходимо иметь в виду, что некоторые антибиотики в процессе развития микробов накапливаются внутри клеток продуцента, практически не выделяясь в окружающую среду. Поэтому определение антибиотических свойств организмов следует проводить как в культуральной жидкости, так и в экстрактах. Обычно для экстракции антибиотика из клеток продуцента применяют органические растворители (этиловый спирт, подкисленный этиловый спирт, ацетон и другие вещества).

Для оценки антибиотических свойств микроорганизмов, выросших в жидких средах, можно использовать метод последовательных разведении и метод бумажных дисков.

Метод бумажных дисков . На агаровую пластинку в чашке Петри высевают соответствующий тест-организм. Затем чашки с засеянным тест-микробом подсушивают в термостате при 37 °C в течение 20 мин. На одной чашке, т.е. в отношении одного тест-организма, может быть испытано одновременно 7 культуральных жидкостей.

Диски из фильтровальной бумаги диаметром 8 мм заготавливают впрок, стерилизуют в автоклаве под давлением выше нормального на одну атмосферу в течение 30 мин.

Стерильный диск фильтровальной бумаги захватывают стерильным пинцетом и смачивают в испытуемой культуральной жидкости, затем накладывают на поверхность питательного агара, засеянного тест-микробом. Чашку с тесторганизмом и бумажными дисками помещают в термостат при температуре, оптимальной для роста тест-организма, на 24 ч, если это бактериальные формы тест-микроба, и на промежуток времени от 48 до 72 ч для грибных или дрожжеподобных форм.

При наличии антибиотического вещества в испытуемой культуральной жидкости вокруг диска образуется зона задержки роста тест-микроба.

Приведенные методы пригодны для определения антибиотической активности микроорганизмов только в отношении бактерии, актиномицетов, дрожжевых и дрожжеподобных организмов и грибов. Для выяснения антивирусного или антиопухолевого действия организмов в силу специфичности этих объектов используют другие методы, описанные в 3.7.3, 3.7.4.

3.7.3 Определение антивирусного действия антибиотиков

Вирусы – внутриклеточные паразиты и поэтому не могут развиваться в виде «чистой культуры» вне клеток своего хозяина. Это обстоятельство и заставляет применять другие методы первоначального отбора активных веществ, отвечающие особенностям развития вирусов.

Метод тканевых культур . Существует несколько вариантов метода тканевых культур, но наиболее удобен метод использования переживающих кусочков хорион-аллантоисной ткани куриного эмбриона в модификации Тама, Фалкерса и Хорсфолла (1953).

Из верхней части куриного яйца с 10-11-дневным эмбрионом вырезают стерильными ножницами шесть кусочков скорлупы с прилегающей к ней тканью хорион-аллантоисной оболочки. Кусочки ткани осторожно отделяют от скорлупы и промывают буферным раствором. Каждый такой кусочек ткани помещают в пробирку с 1 мл среды следующего состава, в процентах (%): NaCl – 0,68, KCl – 0,04, CaCl₂ – 0,02, MgSO₄ – 0,01, NaH₂PO₄ – 0,0125, NaHCO₃ – 0,22, глюкоза – 1,0.

Кроме того, в каждую пробирку добавляют пенициллин (100 ед/мл), с тем чтобы предохранить ткань от загрязнения (развития микроорганизмов). Пробирки устанавливают в специальный медленно (около 12 об/ч) вращающийся барабан.

Для выяснения антивирусного действия продуктов жизнедеятельности определенного организма кусочки ткани заражают соответствующим видом вирусов и вносят в пробирки, содержащие культуральную жидкость (при рН 7,0) исследуемого организма. Пробирки помещают в барабан на 48 ч.

Если культуральная жидкость обладает антивирусным действием, то в среде, окружающей ткань, не будет обнаружено вируса. При отсутствии антивирусного действия вирусы будут интенсивно размножаться в клетках ткани, что может быть легко обнаружено методом титрования на эритроцитах.

Метод оценки антивирусных свойств культуральных жидкостей различных микроорганизмов прост, удобен и позволяет сравнительно быстро получить необходимый ответ при массовых испытаниях.

Метод с использованием листьев растений разработан для выяснения антивирусного действия антибиотиков по отношению к вирусу табачной мозаики.

Микроорганизм выращивают на агаровой пластинке в чашке Петри. После достаточно хорошего развития микроба из агара вырезают блочки, которые затем прикрепляют с помощью расплавленной желатины к листьям дурмана, предварительно зараженным вирусом табачной мозаики. Для предохранения от инфекции к желатину добавляют пенициллин. Листья дурмана с агаровыми блочками помещают на несколько дней во влажные камеры. В течение этого периода поверхность листа дурмана покрывается очагами некроза. Но если находящееся в агаровом блочке антибиотическое вещество, образуемое изучаемым организмом, подавляет развитие вируса, то вокруг такого блочка не будет некротических образований, т.е. поверхность листа в зоне действия антибиотиков будет свободной от поражения вирусом табачной мозаики (рисунок 9).

1 – очаги некроза, вызванные вирусом табачной мозаики; 2 – наличие противовирусного действия; 3 – отсутствие действия на вирусы.

Рисунок 9 – Использование листьев дурмана для определения антивирусного действия антибиотиков (по Шорину и др., 1956)

Для окончательной оценки противовирусного действия антибиотических препаратов необходимо использовать животных (чаще всего мышей) или куриные эмбрионы, зараженные вирусами.

3.7.4 Определение противофаговой активности

Бактерио- и актинофаги – это вирусы микроорганизмов, обладающие рядом свойств, общих с вирусами растений и животных. Определение противофаговой активности микроорганизмов основано на тех же принципах, что и определение противобактериальных свойств организмов.

Культуру, изучаемую на антифаговые свойства, высевают на агаровую или в жидкую среду, благоприятную для образования антибиотического вещества. В качестве тест-объекта используют смесь бактерий и специфического для этой бактерии фага.

При использовании одного из диффузионных методов (метода агаровых блочков, лунок в толще агаровой пластинки, штрихов и т. д.) наблюдается следующая картина. Если антибиотическое вещество подавляет рост фага, то в зоне диффузии антибиотика будет происходить рост используемой бактерии, на остальной же поверхности агаровой пластинки под действием развивающегося фага бактерии будут лизироваться, и поверхность пластинки останется чистой.

Если же под действием изучаемого биологически активного вещества не произойдет развития бактерий и в зоне его диффузии, то это может означать, что используемый в опытах организм не образует противофагового вещества или же образуемое антибиотическое вещество подавляет развитие, как фага, так и бактерии. Последнее легко проверить, если в качестве тест-организма взять только бактерию. Противовирусным действием обладает ряд антибиотических веществ, таких как эрлихин, луридин, фумагиллин, гелиомицин, вирусин и др.

3.7.5 Определение противоракового действия антибиотиков

Не всегда антираковое действие препарата совпадает с антибактериальным или антигрибным действием. Поэтому для определения противораковой активности культуральных жидкостей или очищенных препаратов в качестве тест-объектов используют непосредственно раковые клетки. С этой целью применяют методы, основанные на использовании экспериментальных животных, культуры тканей или свободноплавающих в отдельных полостях организма опухолевых клеток (асцитные клетки), окончательная оценка антиопухолевого действия испытуемого вещества проводится в опытах на животных.

Методы с использованием экспериментальных животных . В качестве тест-объекта используются клетки асцитного рака Эрлиха у мышей (клетки находятся в виде взвеси в асцитической жидкости животных). Взвесь асцитных раковых клеток смешивается с равным объемом изучаемого антибиотического препарата и смесь помещается в рефрижератор при 4 °C на четыре часа, после чего ее подкожно прививают мышам.

Для контрольных животных вместо исследуемого препарата используется физиологический раствор. Через 10 дней мышей убивают и определяют наличие опухолей и их размеры. Если изучаемый препарат убивает асцитные раковые клетки, то они, естественно, не дадут образования опухолей.

Тест-объектом могут служить не только клетки асцитного рака Эрлиха, но и других опухолей, полученных экспериментальным путем у мышей и крыс. Использование клеток различных опухолей связано с необходимостью более широкого изучения противоопухолевого действия исследуемых препаратов, для более точного определения значения изучаемой культуральной жидкости или антибиотика в отношении их действия на раковые клетки.

Прежде чем использовать опухоль в качестве тест-материала, необходимо из опухолевых тканей получить тонкую взвесь. С этой целью в стерильных условиях вылущивают опухоль, тщательно, очищают от некротических участков и несколько раз промывают стерильным физиологическим раствором. После этого отобранные в чашки Петри кусочки опухоли измельчают ножницами до получения гомогенной кашицы и разводят примерно в 2 раза стерильным физиологическим раствором. После тщательного размешивания взвесь фильтруют через 2 слоя стерильной марли. Затем определяют количество опухолевых частиц, содержащихся в 1 мм взвеси (подсчет проводят в камере Горяева). Если при подсчете оказывается, что количество частиц в 1 мм3 незначительно, то полученную взвесь концентрируют методом центрифугирования. Надосадочную жидкость отсасывают, а опухолевые клетки, осевшие на дно пробирки, разводят нужным объемом стерильного физиологического раствора.

В дальнейшем постановка опыта со взвесью опухолевых клеток, приготовленной из опухоли животных, такая же, как и с клетками асцитного рака Эрлиха. Различие лишь в некотором удлинении срока наблюдения (до 12 дней).

Чашечный метод . Данный метод служит для определения действия изучаемых антибиотических препаратов на раковые клетки. Тест-объектом служат клетки асцитного рака, которые смешиваются с теплой агаровой средой (пептон, глюкоза, плазма крови) и разливаются в чашки Петри. На застывшую агаровую пластинку, содержащую клетки асцитного рака, накладывают агаровые блочки с выросшей культурой микроорганизма или диски фильтровальной бумаги, предварительно смоченные культуральной жидкостью или раствором очищенного препарата. Чашки помещают в холодильник на несколько часов для диффузии изучаемых веществ в толщу агара, содержащего асцитные раковые клетки. После этого чашки помещают в термостат при 37 °C на несколько часов и затем, вынув их из термостата, освобождают от агаровых блочков или дисков фильтровальной бумаги. Поверхность агаровых пластинок заливают 0,05 %-ным раствором метиленового синего. Чашки покрывают стеклянными пластинками, помещают в термостат на несколько часов. Если изучаемые препараты убивают клетки асцитного рака, то на месте агаровых блочков или дисков фильтровальной бумаги появятся голубые зоны. Свойство обесцвечивать метиленовый синий, т.е. превращать его в лейкосоединение, связано с выделением живыми асцитными клетками ферментов дегидраз. При отсутствии действия антибиотика на раковые клетки асцитного рака вся поверхность агаровой пластинки будет бесцветной так как убитые клетки не выделяют дегидразы и метиловый синий не обесцвечивается.

Способностью восстанавливать метиленовый синий обладают взвеси клеток различных опухолей животных и человека. Однако в случае использования взвеси клеток солидных опухолей их количество в 1 мл взвеси, необходимое для восстановления метиленового синего, различно (таблица 5).

Приведенные данные показывают, что пользуясь чашечным методом вполне возможно вести отбор противораковых веществ на раковых клетках человека, так как взвеси последних, как и. клетки асцитного рака, восстанавливают метиленовый синий.

Следует отметить, что дегидразная активность раковых клеток может обнаруживаться не только с помощью метиленового синего, но и с помощью ряда других веществ, например 2,6-дихлорфе-нолиндофенола, солей тетразола.

Препараты, подавляющие или тормозящие рост опухоли, обычно подавляют и дегидразную активность соответствующей опухоли.

Таблица 5 – Количество клеток различных опухолей животных и человека, необходимое для восстановления метиленового синего (по Талызиной, 1960)

Пробирочный метод . В качестве определенной модификации чашечного метода является метод испытания противораковой активности антибиотиков в пробирках. Метод состоит в том, что в стандартные пробирки вносят по 0,5 мл испытуемой культуральной жидкости и взвеси клеток асцитного рака Эрлиха (конечная концентрация клеток в 1 мл 500000), затем добавляют 2 мл расплавленной агаровой среды, содержащей метиленовый синий. В контрольные пробирки вместо испытуемой культуральной жидкости добавляют 0,5 мл среды, на которой выращивается изучаемый организм. После перемешивания пробирки помещают на 3-4 ч в термостат при 36-37 °С.

Если содержимое пробирок окрашивается метиленовым синим, то это указывает на то, что испытуемый препарат подавляет дегидразную активность клеток асцитного рака.

Преимущество пробирочного метода по сравнению с чашечным в том, что при этом происходит непосредственный контакт антибиотика с асцитными клетками Эрлиха независимо от степени диффузии изучаемого препарата в агар.

Использование микроорганизмов при изыскании противораковых антибиотиков. Обмен веществ в опухолевых клетках отличается от обмена нормальных клеток; различие, в частности, определяется интенсивностью дыхания, так в опухолевых клетках оно значительно снижено. Исходя из этого, высказано предположение о возможности использования мутантов микроорганизмов, имеющих пониженный коэффициент дыхания, в качестве тест-объектов для поисков противораковых антибиотиков.

В результате ультрафиолетового облучения и действия уретана удалось получить мутанты стафилококков, бактерий кишечной группы и других организмов с пониженным коэффициентом окисления. Поглощение кислорода у таких микроорганизмов может составлять от 20 % до 80 % по сравнению с дыханием исходных родительских культур. В качестве тест-организмов для определения антиопухолевого действия культуральных жидкостей микроорганизмов можно также применять мутанты дрожжевых организмов с пониженным коэффициентом дыхания.

Сравнивая чувствительность метода с использованием асцитных клеток Эрлиха и метода с биохимическими мутантами микроорганизмов, следует заключить, что биохимические мутанты – более чувствительные тесты при определении противоопухолевого действия микроорганизмов.

Использование опухолевых клеток, выращенных in vitro, для отбора организмов, образующих противоопухолевые антибиотики. В последнее время оказалось возможным культивировать некоторые опухолевые клетки в искусственных условиях (in vitro) подобно тому, как это осуществляется в отношении микроорганизмов. Лейкемические клетки мышей могут расти и размножаться в среде, содержащей пептон, диализированную лошадиную сыворотку и фолиевую кислоту (10 мкг/мл). Это позволяет использовать перевиваемые штаммы клеток рака человека для изучения противоопухолевого действия некоторых антибиотиков. С этой целью клетки перевиваемых штаммов выращивают в матрацах на специальной среде с добавлением 10 % телячьей сыворотки. Культивирование проводят при 36 °С. Через 6-7 суток среду удаляют и слой клеток снимают с поверхности стекла 0,02 %-ным раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты. Через 15-20 мин инкубации в термостате клетки переходят в суспензию.

Способность некоторых опухолевых клеток размножаться в пробирках позволяет применять их в качестве тест-объекта при поиске, выделении и очистке новых антибиотических веществ, обладающих противоопухолевой активностью.

С этой целью можно использовать опухолевые клетки лимфолимы. Для получения асцита клеток лимфолимы белым мышам вводят внутрибрюшинно по 0,3 мл взвеси асцитных клеток. Через 10-12 дней асцит стерильно отбирается и сразу же вносится в пробирки с вышеназванной средой для выращивания клеток в пробирках. Количество среды в каждой пробирке равняется 2 мл. При этих условиях через 48 ч инкубации при 36,5 °C в пробирках без перемешивания происходит увеличение числа клеток в 1,5-2 раза. Размножение клеток в культуре учитывается подсчетом в камере Горяева.

Если исследуемый препарат тормозит развитие и размножение клеток асцита, то это указывает на его антиопухолевое действие.

Применение этого метода позволяет производить первичный отбор противоопухолевых антибиотиков на стадии культуральной жидкости, осуществлять выделение и химическую очистку отобранных антибиотиков. Причем удается обнаружить и выделить противоопухолевые антибиотики, не обладающие подавляющим действием в отношении обычных тест-организмов, биохимического мутанта стафилококка и не действующие на дегидразную активность опухолевых клеток лимфолимы.

Количественное определение антибиотиков в культуральных жидкостях, готовых препаратах или в разнообразных растворах осуществляют различными методами: биологическими, химическими и физико-химическими. Наиболее распространены биологические методы, не требующие специального дорогостоящего оборудования и дающие довольно точные результаты.

3.8.1 Биологические методы количественного определения антибиотиков

3.8.2. Химические и физико-химические методы определения различных групп антибиотиков

Химические и физико-химические методы определения различных групп антибиотиков все шире и шире используются в лабораторной практике. Их преимущество по сравнению с биологическими методами состоит в быстром проведении анализов и, следовательно, в быстром получении ответа. В ряде случаев химические и физико-химические методы несколько уступают по точности биологическим методам. Однако их основное свойство – высокая скорость определения – способствует широкому практическому использованию.

К химическим и физико-химическим методам относят колориметрические и спектрофотометрические методы, основанные на образовании различных соединений или использовании определенных свойств антибиотиков: цветные реакции, исчезновение характерных полос в ультрафиолетовой или инфракрасной частях спектра под действием различных веществ (кислот, щелочей и др.).

Чисто химические методы определения количества антибиотиков применяются очень редко. Описано несколько модификаций определения пенициллинов, в основу которых положено поглощение йода продуктами гидролиза этого вещества. Определение пенициллина можно также производить ацидометрическим способом. При расщеплении молекулы пенициллина с помощью пенициллинацилазы или щелочи с образованием пенициллановой кислоты происходит освобождение одной карбоксильной группы, которую можно учесть титрованием.

Чаще применяют колориметрические и спектрофотометрические методы определения концентрации антибиотиков. В основу колориметрических методов положен принцип превращения препарата или его отдельных группировок в окрашенные соединения. Спектрофотометрические методы основаны на свойстве многих антибиотиков давать характерный спектр поглощения в видимом свете или в ультрафиолетовой области.

Определение стрептомицина основано на характерных реакциях различных функциональных групп молекулы антибиотика. Чаще всего применяется мальтольный метод, который состоит в том, что при щелочном гидролизе стрептомицина из стрептозной части молекулы образуется мальтол, который с солями трехвалентного железа дает окрашенное соединение. Этим методом можно определять стрептомицин в растворах товарных препаратов и в культуральных жидкостях после соответствующей их очистки.

Для получения вполне воспроизводимых результатов при работе указанным методом рекомендуется использовать следующую методику: к 10 мл стрептомицина (концентрация 100-300 мкг/мл) добавить 2 мл 0,2 н. гидроксида натрия, опустить сосуд в кипящую водяную баню на 4 мин, затем охладить в водопроводной воде в течение 3 мин, добавить 8 мл 1%-ного раствора железоаммиачных квасцов в 0,55 н. серной кислоте и точно через 3 мин после этого измерить удельную экстинкцию (оптическую плотность, или поглощение).

Для определения маннозидострептомицина, который обычно образуется в определенном количестве вместе со стрептомицином, применяют антрон – вещество, обладающее способностью давать с углеводами в крепких растворах серной кислоты соединение интенсивно зеленого цвета. Определение оптической плотности этого окрашенного соединения обычно проводят на фотоэлектроколориметре.

Определение тетрациклиновых антибиотиков физико-химическими методами также основано на образовании окрашиваемых соединений при взаимодействии этих антибиотиков с хлористым железом, солями меди, азотной или серной кислотами. Тетрациклиновые антибиотики количественно могут определяться спектрофотометрическим методом. Метод основан на исчезновении одного из характерных максимумов поглощения раствора антибиотика после щелочного гидролиза.

Описано несколько физико-химических методов определения эритромицина, из которых наиболее широко распространенными являются колориметрический и спектрофотометрический методы.

Колориметрический метод определения эритромицина основан на изменении оптической плотности раствора антибиотика после реакции его с серной кислотой (27 н.). При взаимодействии эритромицина с серной кислотой образуются продукты, окрашенные в желтый цвет.

Замечено, что оптическая плотность испытуемого раствора антибиотика и серной кислоты зависит от температуры сливаемых растворов. Чтобы исключить это влияние, необходимо измерять оптическую плотность раствора антибиотика после нагревания его с 18 н. H₂S0₄ при 100 °C.

Физико-химический метод нашел широкое практическое применение при определении циклосерина. Метод основан на реакции циклосерина с нитропруссидным реагентом в кислой среде. В результате реакции образуется комплексное соединение голубого цвета, концентрацию которого легко измерить колориметрически.

Нитропруссидный реагент представляет собой смесь равных объемов 4 %-ного раствора нитропруссида натрия и 4 н. раствора NaOH. Реагент можно готовить за 16-24 ч до начала определения и хранить в холодильнике, лучше же готовить реагент перед началом определения.

Метод определения циклосерина состоит в следующем: к 1 мл раствора циклосерина (концентрация от 50 до 200 мкг/мл) добавляют 3 мл 1 н. раствора уксусной кислоты и 1 мл нитропруссидного реагента. После перемешивания раствор оставляют при комнатной температуре в течение 10 мин и измеряют величину оптической плотности.

Конец ознакомительного фрагмента.