Общее определение метода анализа
Аналитический метод, в котором концентрация определяемого компонента устанавливается по интенсивности люминесценции (свечения), возбуждаемой внешним источником энергии (обычно ультрафиолетовым или видимым светом). Принцип основан на том, что молекулы поглощают энергию и переходят в возбужденное состояние, а затем возвращаются в основное состояние с испусканием фотона. Чем выше концентрация люминесцирующего вещества, тем интенсивнее свечение (при соблюдении линейной зависимости в рабочих диапазонах).
Близкие слова
- люминесцентная спектроскопия
- флуориметрия (как частный случай)
В лаборатории провели люминесцентный анализ пробы воды на содержание хинина.
Люминесцентный анализ позволяет определять следовые количества загрязнителей, невидимых глазу.
Флуоресцентный анализ
Разновидность люминесцентного анализа, использующая флуоресценцию — свечение, которое прекращается практически мгновенно (за наносекунды) после прекращения облучения. Этот метод наиболее распространен из-за высокой скорости измерений и удобства работы с растворами. Часто требует наличия у анализируемого вещества собственной флуоресценции или использования специальных люминофоров.
Близкие слова
- флуориметрический анализ
- спектроскопия флуоресценции
Флуоресцентный анализ ДНК позволяет быстро оценить количество генетического материала в пробе.
Микроскоп с функцией флуоресцентного анализа показал наличие специфических белков в клетках.
Фосфоресцентный анализ
Метод, основанный на фосфоресценции — длительном послесвечении, которое может продолжаться от миллисекунд до нескольких часов после выключения источника возбуждения. Задержка во времени позволяет физически отделить сигнал анализа от фонового рассеянного света и быстрой флуоресценции примесей, что значительно повышает отношение сигнал/шум.
Близкие слова
- фосфориметрический анализ
- спектроскопия фосфоресценции
Фосфоресцентный анализ используется для изучения жестких матриц, где фоновая интерференция высока.
Этот метод применим к твердым образцам и порошкам, обладающим длительным послесвечением.
Принцип работы и отличие от абсорбционных методов
Главное преимущество люминесцентного анализа перед методами поглощения света (например, УФ-спектроскопией) заключается в способе регистрации сигнала. В абсорбционной спектроскопии измеряется разность между интенсивностью падающего и прошедшего через образец света. При низких концентрациях эта разница ничтожно мала, что ограничивает чувствительность метода. В люминесцентном анализе детектор расположен под углом 90 градусов к источнику возбуждения и регистрирует только свет, излучаемый самим веществом, на темном фоне. Это позволяет фиксировать очень слабые сигналы от единичных молекул.
Однако метод имеет свои ограничения: он применим только к веществам, способным люминесцировать (люминофорам). Если анализируемое соединение не светится само по себе, его необходимо химически связать с флуоресцентной меткой или использовать косвенные методы определения.
Где применяется метод
Широкое распространение люминесцентный анализ получил в биохимии и медицине. Он является основой для иммуноферментного анализа (ИФА) с флуоресцентной детекцией, который позволяет обнаруживать гормоны, антитела и маркеры заболеваний в крови. В экологии метод используют для контроля загрязнения водоемов нефтепродуктами и тяжелыми металлами (через комплексообразование).
В фармацевтике люминесцентный анализ помогает контролировать чистоту лекарств, выявляя примеси, которые могут давать ложноположительные результаты при других методах. В криминалистике флуоресценция используется для выявления следов биологических жидкостей или поддельных документов.
Факторы, влияющие на точность
На результат люминесцентного анализа сильно влияют внешние условия. Температура: при нагревании интенсивность свечения обычно падает из-за безызлучательных процессов дезактивации возбужденных состояний. Кислотность среды (pH): многие органические люминофоры меняют свой спектр или яркость в зависимости от протонирования молекулы. Присутствие кислорода: кислород является эффективным гасителем флуоресценции и фосфоресценции, поэтому для прецизионных измерений растворы часто дегазируют.
Также важна концентрация самого анализируемого вещества: при слишком высоких значениях возникает эффект самопоглощения (когда излученный фотон поглощается соседней молекулой того же вещества) и тушение концентрации, что нарушает линейную зависимость интенсивности от концентрации.